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三七皂甙Rg1對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞損傷的防護作用

2012-06-19 09:49:42李劍瑜劉毅高波戴富林武凡
環(huán)球中醫(yī)藥 2012年1期
關(guān)鍵詞:皂甙泳道電泳

李劍瑜 劉毅 高波 戴富林 武凡

現(xiàn)在廣泛認(rèn)為脂多糖(liposaccharide,LPS)是導(dǎo)致膿毒血癥、敗血癥休克的直接原因,并可導(dǎo)致多功能不全綜合征(multi organ dysfunction syndrome,MODS)發(fā)生,而肝臟則是MODS最早受損和受損最為嚴(yán)重的臟器[1,2]。由于缺乏簡便有效的治療藥物,對MODS的治療至今未取得突破性的進展。三七皂甙Rg1是中國傳統(tǒng)中草藥三七的單體成分,其對急性肝損傷的作用和保護機理,目前鮮見報導(dǎo)。本實驗用透射電鏡、DNA凝膠電泳、單細(xì)胞凝膠電泳法(single cell gel electrophoresis assay,SCGE,又稱慧星電泳)探討LPS所致肝細(xì)胞損害的特點,并探討三七皂甙Rg1抗肝細(xì)胞損害的作用及作用機理,為急性肝細(xì)胞損傷的治療決策提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LPS、膠原酶Ⅳ、percoll均購自sigma公司;triton x-100購于Furka公司,三七皂甙Rg1為昆明植物研究所產(chǎn)品。

1.2 實驗動物

Wistar大鼠32只,體重(200±12)g。

1.3 實驗方法

1.3.1 肝細(xì)胞分離與純化 膠原酶原位灌流法分離大鼠肝細(xì)胞,參照文獻[3]進行。取Wistar大鼠32只,隨機分為4組,每組8只,膠原酶原位灌流法分離大鼠肝細(xì)胞后用臺盼藍排除試驗檢測肝細(xì)胞存活率>90%,計算細(xì)胞濃度,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為106個/ml。于正常對照組、LPS組、LPS+Rg1組、LPS+Quinacrine組分別加入20mmol/L PBS、3mg/L LPS、3mg/L LPS+20mmol/LRg1、3mg/L LPS+5μmol/L Quinaceine,于施加因素后0、2、4、6、8、12小時分別收集肝細(xì)胞和肝細(xì)胞培養(yǎng)液進行各指標(biāo)測定。

1.3.2 透射電鏡觀察 肝細(xì)胞收獲后,離心棄上清,PBS漂洗三次,2%戊二醛液固定,1mol/L二甲砷酸緩沖液漂洗,1%四氧化鋨固定,丙酮系列脫水,環(huán)氧樹脂包埋,切片染色后觀察。

1.3.3 DNA 片段的提取 參照文獻[4]提取培養(yǎng)肝細(xì)胞的DNA片段,經(jīng)空氣干燥后,溶于20μl的雙蒸水中,4℃保存。用于DNA梯度電泳。

1.3.4 SCGE檢測 參照文獻[3]并加以改進。于45℃,100μl 1%正常熔點瓊脂糖的無Ca2+、Mg2+PBS懸液澆注到磨粗的Dakin載玻片上將純化后的肝細(xì)胞進行固化成三層。然后將玻片置水平電泳槽液面下0.25cm,在堿性電泳緩沖液中放置20分鐘后25V,300mA,電泳20分鐘。用0.4mol/L Tris(pH 7.5)浸洗,每次15分鐘,共3次,然后用溴化乙錠水溶液染色。染色后的單個肝細(xì)胞應(yīng)盡快在熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計軟件為SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包。SCGE玻片用CM-2000B彩色醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)分析。數(shù)據(jù)用±s表示,并經(jīng)正態(tài)性檢驗以及方差齊性檢驗。凋亡與壞死的時相性變化相關(guān)分析采用pearson's檢驗。Rg1對大鼠肝細(xì)胞損害的抑制作用數(shù)據(jù)采用方差分析和組間q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

大鼠肝細(xì)胞在加入LPS(終濃度3mg/L)后培養(yǎng)2小時,透射電鏡下觀察,圖1可見較早期調(diào)亡的肝細(xì)胞。染色質(zhì)固縮聚集于核膜,呈境界分明的塊狀或新月狀,在上方可見一個較小的凋亡小體。圖2可見正在形成凋亡小體的肝細(xì)胞,該細(xì)胞胞質(zhì)濃縮,細(xì)胞周圍有大小不等的凋亡小體。

圖1 LPS處理2小時后肝細(xì)胞凋亡的電鏡檢測(×6000)

圖2 LPS處理2小時后肝細(xì)胞凋亡的電鏡檢測(×3500)

2.2 DNA梯度電泳

各組大鼠肝細(xì)胞在加入施加因素后于4小時后提取細(xì)胞DNA,在1.5%的瓊脂糖上電泳,35V,電泳2小時,泳道1為marker,泳道2和3為LPS組,泳道4為LPS+Rg1組、泳道5為LPS+Quinacrine組,泳道6為正常對照組,泳道2和3均出現(xiàn)典型的梯狀條帶,說明有明顯的凋亡現(xiàn)象,泳道4和泳道5的條帶顏色較淺,說明凋亡細(xì)胞明顯減少,而泳道6對照組無此現(xiàn)象,說明沒有凋亡細(xì)胞(見圖3)。

圖3 DNA梯度電泳

2.3 單細(xì)胞凝膠電泳檢測

在通常情況下,DNA雙鏈以組蛋白為核心。盤旋形成核小體。在核小體中DNA為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)。如果有去污劑進入細(xì)胞,核蛋白被濃鹽提取,DNA便形成殘留的類核,鏡下可見熒光強度較強的圖形頭部,無拖尾,為正常細(xì)胞(見圖4A)。如果類核中DNA斷裂,就會在核外形成一個DNA暈輪,DNA斷裂將引起超螺旋松散,電泳時DNA斷裂片向陽極伸展,形成特征性慧星(見圖4C)。細(xì)胞凋亡時DNA在質(zhì)膜損傷以前斷裂,這種斷裂很容易被這種方法顯示,被稱為“凋亡之慧星”。凋亡慧星的數(shù)量可以代表凋亡細(xì)胞的數(shù)量。在慧星電泳中,壞死細(xì)胞由于細(xì)胞膜受損,DNA隨機斷裂,形成沒有明顯頭部的拖尾(見圖4B)。因為慧星電泳能將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞定量地區(qū)分開來,所以更有利于凋亡的深入研究。原代培養(yǎng)肝細(xì)胞于各培養(yǎng)皿中加入處理因素后培養(yǎng)0、2、4、6、8、12小時進行電泳。圖4為電泳2小時的各組細(xì)胞,對照組為正常細(xì)胞(見圖4A),而LPS組為凋亡細(xì)胞(見圖4C),壞死細(xì)胞(見圖4B)。

圖4 單細(xì)胞凝膠電泳檢測

由表1可見用SCGE法檢測LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞損害的時相性變化,6小時內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)增加較快,8小時后壞死細(xì)胞數(shù)急劇增加,12小時壞死細(xì)胞占絕大多數(shù)。

由表2可見三七皂甙Rg1明顯抑制LPS所致的肝細(xì)胞凋亡與壞死,其效果與凋亡抑制劑Quinacrine無明顯差異。

表1 用SCGE法檢測LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與壞死的時相性變化(n=8,±s,%)

表1 用SCGE法檢測LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與壞死的時相性變化(n=8,±s,%)

注:凋亡細(xì)胞與處理時間的相關(guān)性r=0.971,P<0.01;壞死細(xì)胞與處理時間的相關(guān)性r=0.941,P<0.01。

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表2 Rg1對LPS誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)8小時大鼠肝細(xì)胞損害的抑制作用(n=8,±s)

表2 Rg1對LPS誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)8小時大鼠肝細(xì)胞損害的抑制作用(n=8,±s)

注:與正常對照組細(xì)胞相比aP<0.01;與LPS組相比b P<0.01。

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3 討論

已知認(rèn)為肝臟是LPS導(dǎo)致受損最為嚴(yán)重的器官[1,2],但受損的性質(zhì)和機制尚存在爭議[5],更缺乏有效的治療藥物。三七皂甙具有抗炎、抗氧化、抗衰老作用,但對急性肝細(xì)胞損傷的作用機理尚未見報導(dǎo)。在本實驗中,用LPS(3mg/L)處理原代培養(yǎng)肝細(xì)胞2小時,電鏡可見典型的凋亡細(xì)胞和凋亡小體。DNA凝膠電泳也表現(xiàn)明顯的凋亡梯度,用SCGE檢測發(fā)現(xiàn)LPS(3mg/L)處理2小時肝細(xì)胞即可得到凋亡細(xì)胞為7.2%±2.6%,壞死細(xì)胞為10.2%±2.4%,提示LPS引起的肝損害的性質(zhì)及嚴(yán)重程度。這說明LPS可以直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與壞死。LPS引起的肝細(xì)胞損害的時相性變化,至今也未見報導(dǎo),本資料用改進的SCGE法做進一步探討發(fā)現(xiàn)LPS引起的肝細(xì)胞凋亡與壞死都有顯著的時相性變化。

SCGE也叫慧星電泳,是一種直接顯示單個細(xì)胞DNA損傷的微電泳技術(shù)[2,6]。但SCGE鮮見應(yīng)用于肝細(xì)胞損傷研究的報道。由于SCGE能將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞定量地區(qū)分開,而且敏感性高、方法簡便、價格便宜,因而可以成批的檢測標(biāo)本,SCGE比起昂貴的1995年Vermas首次使用的Annexinv/pI法定量分析凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞顯示了更多的優(yōu)越性,所以有利于肝損害的研究。用SCGE檢測原代培養(yǎng)肝細(xì)胞,加3mg/L LPS 2小時可以觀察到明顯的肝細(xì)胞凋亡與壞死,這比最近報導(dǎo)的使用LPS 10mg/L 4小時發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞敏感的多[6]。表1顯示在8小時之內(nèi)凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞的增加與處理時間有明顯的相關(guān)性,到12小時凋亡細(xì)胞數(shù)急劇下降,而壞死細(xì)胞數(shù)從第8小時迅速上升,于12小時占絕大多數(shù)。本資料提示LPS誘導(dǎo)的肝臟損害是一個從肝細(xì)胞凋亡到壞死的過程。這一過程可能是細(xì)胞死亡連鎖反應(yīng)的不同階段,其原因可能在于雖然凋亡與壞死是細(xì)胞死亡的兩種不同形式,但兩者不是毫無關(guān)聯(lián)的。它們之前的交錯在于無論哪種死亡形式,最終都伴有能量不足、大分子物質(zhì)的降解以及自由基的形成[4],另一方面同一種誘導(dǎo)因素,如本實驗中刺激因素LPS,由于時間的不同而導(dǎo)致連鎖反應(yīng)的兩個階段。

本資料用SCGE法表明LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損害的存在以及嚴(yán)重程度,因此尋找有效的特異治療MODS的藥物成為筆者進一步研究的焦點。Quinacrine可以抑制肝損害,但考慮到Quinacrine的作用有臟器選擇性及效應(yīng)多樣性,該藥在進入治療急性肝損傷前,仍有許多向題尚未解決[3,4]。在國外學(xué)者把MODS稱為介質(zhì)病,在用介質(zhì)療法顯得蒼白無力的時候[3],本課題組用靈敏度高、價格便宜的SCGE對中藥進行篩選。研究發(fā)現(xiàn)具有抗炎、抗氧化、抗衰老作用的三七皂甙單體Rg1對急性肝損害有明顯抑制作用,顯著地抑制肝細(xì)胞凋亡與壞死,在治療急性肝損傷有著Quinacrine不可替代的優(yōu)越性,預(yù)示其應(yīng)用的廣泛前景。

總之,本資料提示SCGE法是研究肝細(xì)胞損害并進行藥物篩選的良好方法。用該法筆者發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損害是一個從肝細(xì)胞凋亡到壞死的過程,并證實三七皂甙Rg1為肝細(xì)胞損害的有效的保護劑,深化了對MODS的認(rèn)識,為MODS的治療提供新的思路。

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