劉啟明

(江蘇省睢寧縣人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 江蘇 睢寧 221200)

程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)是1995年Shibahara等在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因，不僅對細(xì)胞的程序性死亡進(jìn)行重要調(diào)節(jié)，而且通過抑制蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯過程抑制腫瘤細(xì)胞的生長。PDCD4與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，Jansen AP等[1]檢測了60種來自腎臟、肺臟、結(jié)腸、乳腺以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞系中PDCD4的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PDCD4在mRNA水平和蛋白水平上均有表達(dá)降低或缺失。有研究資料[2]顯示，在肺癌組織中PDCD4缺失率高達(dá)83%，而且與腫瘤的惡性程度、TNM分期以及預(yù)后不良密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測NSCLC組織中PDCD4蛋白表達(dá)情況，并探討蛋白的表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系。為探討PDCD4在NSCLC中的發(fā)病機(jī)制、病理診斷、預(yù)后價(jià)值以及選擇治療的靶點(diǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇濰坊市人民醫(yī)院胸外科2006年8月～2010年3月手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本54例，其中男33例，女21例;＜60歲的28例;≥60歲26例;有長期吸煙史22例，無吸煙史32例;鱗癌25例，腺癌29例;高分化11例，中分化31例，低分化12例;Ⅰ期 22例，Ⅱ期10例，Ⅲ ～Ⅳ期22例(依據(jù)2002UICC肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn))。并分別取癌旁組織(遠(yuǎn)離癌灶5CM以上)24例。所有組織標(biāo)本使用中性甲醛固定，石蠟包埋備用。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及來源。YB－6LF智能型生物組織包埋機(jī)(湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)、PHY－Ⅱ病理組織涼烘儀(常州市中威電子儀器公司)、BX41光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、BX－51型生物光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)。

1.2.2 藥品與試劑。鼠抗人PDCD4一抗(北京博奧森生物工程有限公司)、鼠抗人DNMT1一抗(北京博奧森生物工程有限公司)、sABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司)、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)用溶液配制。①中性甲醛固定液配制:甲醛10mL、0.01MPBS 90mL。②蘇木素染液的配制:蘇木素1.0g、無水乙醇10mL、硫酸鋁鉀 20g、蒸餾水 200mL、氧化汞 0.5g。

1.2.4 試驗(yàn)方法。將手術(shù)標(biāo)本使用中性甲醛固定，石蠟包埋，然后切成5μm厚的連續(xù)石蠟切片。兩種染色方法的具體步驟分別如下。

1.2.4.1 HE染色。①切片常規(guī)脫蠟入水;②蘇木素染色，自來水沖洗;1%鹽酸酒精分色，自來水沖洗;伊紅染色，自來水沖洗;梯度酒精脫水、二甲苯透明;③中性樹膠封片。

1.2.4.2 免疫組織化學(xué)染色。①石蠟切片置于60℃烤箱中烤片2h，常規(guī)脫蠟入水;②置于枸櫞酸緩沖液中微波爐抗原修復(fù);③0.01PBS沖洗3min×3次;④3%過氧化氫37℃溫箱孵育10min;⑤0.01PBS沖洗3min×3次;⑥滴加PDCD4，并用PBS取代一抗做空白對照，4℃冰箱過夜;⑦0.01PBS沖洗3min×3次;⑧滴加試劑1，37℃溫箱孵育20min;⑨0.01PBS沖洗3min×3次;⑩滴加試劑 2，37℃溫箱孵育 20min;?0.01PBS 沖洗 3min ×3次;?DAB室溫顯色2min，蒸餾水沖洗終止反應(yīng);?蘇木素輕度復(fù)染細(xì)胞核，自來水沖洗;?梯度酒精脫水、二甲苯透明;?中性樹膠封片，顯微鏡下觀察免疫反應(yīng)陽性結(jié)構(gòu)的著色及分布情況。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定 用PBS代替一抗作陰性對照，以已知陽性片作為陽性對照。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒為陽性染色。參考Monica等的半定量計(jì)數(shù)方法，根據(jù)腫瘤細(xì)胞的染色率進(jìn)行判定。在400倍鏡下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)至少100個(gè)腫瘤細(xì)胞中PDCD4蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞所占百分率。細(xì)胞陽性率＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;最終得分取5個(gè)視野的平均值。規(guī)定0～4分為陰性，5～8分為陽性表達(dá)，9～12分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件，P值取雙側(cè)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PDCD4在NSCLC、癌旁組織中的表達(dá)及與NSCLC患者的臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PDCD4在 NSCLC組織、癌旁組織中的表達(dá) PDCD4在NSCLC、癌旁組織中的表達(dá)陽性率分別為33.3%、75.0%，癌及癌旁組織表達(dá)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。癌較癌旁組織出現(xiàn)低表達(dá)和缺失(見圖1～4)。

表1 PDCD4在肺癌組織、癌旁及正常組織中的表達(dá)(例)

圖1 鱗癌PDCD4的低表達(dá)(×400)

圖2 正常組織PDCD4的表達(dá)(×400)

圖3 腺癌PDCD4的表達(dá)缺失(×400)

圖4 腺癌DNMT1的高表達(dá)(×400)

2.2 PDCD4在NSCLC組織中的表達(dá)與TNM分期的關(guān)系情況見表2。

2.3 PDCD4的表達(dá)與NSCLC組織分化輕度的關(guān)系 PDCD4的表達(dá)與NSCLC組織分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，低、中分化較高分化表達(dá)下降。見表3。

2.4 PDCD4的表達(dá)與NSCLC患者的性別、年齡、吸煙史、病理類型等臨床特征的關(guān)系 除PDCD4表達(dá)在吸煙和不吸煙的患者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表 4。

表2 PDCD4在肺癌組織中表達(dá)與TNM分期的關(guān)系(例)

表3 PDCD4表達(dá)與NSCLC組織分化程度的關(guān)系(例)

表4 PDCD4表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系(例)

3 討論

PDCD4是新發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因，通過一個(gè)保守的a螺旋MA－3結(jié)構(gòu)與真核細(xì)胞翻譯起始因子eIF4A發(fā)生結(jié)合，從而抑制核糖體復(fù)合物的形成和蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PDCD4在人類組織中，例如:肝、肺、腦、食道等組織中都有表達(dá)。在大多數(shù)正常組織細(xì)胞中，PDCD4蛋白主要位于細(xì)胞核中，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生惡性增殖時(shí)，它可以通過NES轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿中[3]。

在人類的多種惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、消化道腫瘤、腦膠質(zhì)瘤、卵巢癌、皮膚癌、淋巴瘤、鼻咽癌等腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)PDCD4表達(dá)下降或缺失。Goke R等[4]研究證實(shí)了PDCD4作為CDK1/cdc2的間接抑制因子，在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中的表達(dá)缺失。Jiang Y等[5]研究人體的肝癌細(xì)胞中的PDCD4的表達(dá)情況，并和周圍正常組織進(jìn)行對照，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中呈現(xiàn)顯著的低表達(dá)。Gao等[6]對手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤患者標(biāo)本30例進(jìn)行分析，結(jié)果提示，PDCD4mRNA、蛋白質(zhì)相比癌旁組織表達(dá)頻率均有不同程度缺失。

目前研究認(rèn)為，PDCD4主要通過抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯過程抑制腫瘤的生長，但詳細(xì)機(jī)制尚不清楚。核轉(zhuǎn)錄因子AP－1參與細(xì)胞的增殖、分化與轉(zhuǎn)化過程[7]，在腫瘤的形成、侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。PDCD4可能通過抑制AP－1的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的生長。其次PDCD4通過與翻譯起始因子elF4A結(jié)合抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程。突變分析表明，PDCD4MA－3區(qū)氨基或羧基末端發(fā)生突變后，與elF4A結(jié)合率降低約90%，從而不能競爭性抑制elF4G的結(jié)合，不能抑制翻譯起始過程的進(jìn)行，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖[8]。近來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在PDCD4mRNA的3＇端非編碼區(qū)存在著miR－21的結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)的功能能夠調(diào)節(jié)PDCD4的水平[9]。Lund等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，miR －21 下調(diào)靶基因PDCD4，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。另外，PDCD4可能還通過影響細(xì)胞周期的進(jìn)程[4]，激活 PI3K－Akt－mTOR－p70S6K信號途徑[11]等途徑影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4在NSCLC組織、癌旁組織中表達(dá)不同，分別為33.3%、75.0%，PDCD4在NSCLC中和正常肺組織相比存在著低表達(dá)和缺失，且兩者相比差異有顯著性。PDCD4表達(dá)缺失可能參與了NSCLC的發(fā)生和發(fā)展，可作為NSCLC的病理診斷的指標(biāo)。Kalinichenko SV等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在鱗癌標(biāo)本中，PDCD4蛋白通常沒有改變，甚至上調(diào)。本組研究結(jié)果與之不同，鱗癌患者PDCD4蛋白表達(dá)亦較正常組織有顯著的減低。本組在有吸煙史的患者中PDCD4蛋白的表達(dá)陽性率為25.0%，無吸煙史的患者為38.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。是否與煙草中的毒性物質(zhì)長期吸入影響肺癌組織中PDCD4的表達(dá)，從而促使細(xì)胞的惡性增殖，有待進(jìn)一步研究。Chen Y等[2]研究認(rèn)為，PDCD4表達(dá)丟失的患者腫瘤惡性程度較高，一般為Ⅲ期的患者。本組資料也提示PDCD4Ⅲ～Ⅳ期的患者PDCD4缺失率更高，與Ⅰ期、Ⅱ期相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示隨著腫瘤的進(jìn)展，PDCD4表達(dá)缺失率提高。而Ⅰ期和Ⅱ期相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，分化差的癌組織PDCD4的缺失顯著，本組病例中低、中和高分化的癌組織中PDCD4的表達(dá)分別為16.7%、29.0%、63.6%，低、中分化組較高分化組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Chen Y等[2]通過對124例原發(fā)型肺癌的所有亞型進(jìn)行免疫組化檢測，得出結(jié)果:PDCD4表達(dá)丟失的患者腫瘤惡性程度較高，PDCD4表達(dá)丟失的患者術(shù)后隨訪病死率高于表達(dá)正常的患者。因此，PDCD4可作為NSCLC的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)。本組資料研究表明，在年齡≥60歲組和＜60歲組、性別、組織類型之間PDCD4表達(dá)沒有差異。

張霞等[13]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤研究中成功地將重組PDCD4基因轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，細(xì)胞表達(dá)PDCD4后，其細(xì)胞增殖明顯受到抑制。Gao F等[14]發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中恢復(fù)PDCD4基因的表達(dá)，能夠抑制細(xì)胞增殖和復(fù)制能力，提示PDCD4基因的重新激活可以作為膠質(zhì)瘤治療的一種新的有效措施。因此，提高腫瘤PDCD4的表達(dá)，有可能成為NSCLC靶向治療途徑。

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