柯野 陳丹 李家洲 謝明權(quán) 羅曉春?

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006;2.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州510300)

蛋白酶是一類重要的工業(yè)用酶，占整個(gè)工業(yè)用酶量的60%以上;其中，堿性蛋白酶約占蛋白酶總量的一半，廣泛應(yīng)用于食品加工、皮革、醫(yī)藥和化工等行業(yè)［1］.目前商業(yè)化的堿性蛋白酶主要來源于芽孢桿菌，來源于真菌的極少［2］.米曲霉(Aspergillus oryzae)是一種能產(chǎn)生多種蛋白酶的真菌，據(jù)2007年對(duì)該菌的全基因組序列報(bào)道，通過對(duì)該基因組的分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌共有134個(gè)蛋白酶基因，其中69個(gè)為外肽酶、65個(gè)為內(nèi)肽酶，但只有少數(shù)蛋白酶的功能與性質(zhì)被解釋清楚［3］.該菌廣泛應(yīng)用于豆醬、醬油和酒類釀造等發(fā)酵工業(yè).在釀造工業(yè)中，米曲霉產(chǎn)生的酸性蛋白酶活力較低(主要以產(chǎn)生堿性蛋白酶和中性蛋白酶為主)，尤其是堿性蛋白酶對(duì)底物蛋白的水解程度對(duì)水解物產(chǎn)生的獨(dú)特風(fēng)味和脫苦味起著關(guān)鍵作用［1，4-5］.目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)米曲霉的研究主要集中于通過優(yōu)化固體(或者液體)發(fā)酵來提高米曲霉蛋白酶的產(chǎn)量或通過分離純化其產(chǎn)生的部分酶進(jìn)行性質(zhì)研究［1，6］.優(yōu)化發(fā)酵條件很難大幅度提高堿性蛋白酶產(chǎn)量，且發(fā)酵過程易受多種因素(如易污染或菌株生長(zhǎng)狀態(tài))影響.另外，米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶種類較多，這增加了堿性蛋白酶的純化難度，阻礙了其進(jìn)一步的開發(fā)利用［7］.有關(guān)該酶的酶學(xué)性質(zhì)、異源表達(dá)和水解特性等的研究目前鮮見報(bào)道.

畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是目前表達(dá)異源蛋白性能較好的系統(tǒng)之一，其操作工藝簡(jiǎn)單，表達(dá)量高.該系統(tǒng)能對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行折疊和翻譯后修飾，獲得具有活性的目的蛋白，此目的蛋白能直接分泌至發(fā)酵液中便于分離與純化.目前已有較多外源基因在該系統(tǒng)中成功表達(dá)的報(bào)道［8］.文中主要通過克隆獲得米曲霉堿性蛋白酶基因，以期能在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行異源表達(dá)，提高其產(chǎn)量，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和水解性質(zhì)進(jìn)行初步研究，為該重組堿性蛋白酶在相關(guān)產(chǎn)業(yè)中的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，改變目前商業(yè)堿性蛋白酶主要來源于芽孢桿菌的局面，并為開發(fā)利用來源于真菌的堿性蛋白酶提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

米曲霉滬釀3.042菌株購(gòu)自上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司，畢赤酵母KM71菌株和表達(dá)載體pPIC9K試劑購(gòu)自Invitrogen公司.

1.1.2 工具酶和試劑

各種工具酶購(gòu)自Takara(大連)公司，PCR擴(kuò)增引物和Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen(廣州)公司，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物購(gòu)自Fermentas公司，牛胰島素氧化B鏈購(gòu)自Sigma公司，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 米曲霉堿性蛋白酶基因的克隆

將米曲霉菌株接種在裝有麩皮的固體培養(yǎng)基(96.41% 麩皮、0.23% 麥芽糖、1.56% 蛋白胨、0.74%KH2PO4、0.06%FeSO4·7H2O，培養(yǎng)基起始含水量為每克麩皮含1.00 mL水)中，25.0℃恒溫培養(yǎng)48 h.收集菌絲體，用液氮研磨，按Trizol試劑操作手冊(cè)提取和鑒定RNA，-70℃保存?zhèn)溆?利用Takara(大連)公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA.據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的米曲霉堿性蛋白酶(Alp)基因序列(登錄號(hào):XM_001820092)設(shè)計(jì)引物.P1引物:5'ATGCAGTCCATCAAGCGTACCT3';P2引物:5'TTAAGCGTTACCGTTGTAGGCAAG3'.以 cDNA為模板，采用P1和P2引物進(jìn)行50 μL體系的PCR反應(yīng).反應(yīng)程序:94℃變性2min;98℃變性10s，55℃退火15 s，72℃延伸2 min;30個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min.純化回收PCR產(chǎn)物，克隆至載體 pSIMPLE-18EcoR V/BAP上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌GT116中，篩選陽性克隆測(cè)序確認(rèn).

1.2.2 酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)堿性蛋白酶基因的P3和P4引物(該引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物不包括堿性蛋白酶基因的信號(hào)肽編碼序列).P3引物:5'CCGGAATTCCCTGTGCAGGAAACCCGC3';P4引物:5'CTAGTTTAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGCGTTACCGTTGTAGGCAAG3'.P3和P4引物下劃線部分的序列上分別帶有EcoR I和Not I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，斜體加粗序列表示增加6個(gè)編碼組氨酸標(biāo)簽的序列.以測(cè)序確認(rèn)后的克隆質(zhì)粒載體作為模板，以P3和P4為引物進(jìn)行50μL的PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序同第1.2.1節(jié);純化回收PCR產(chǎn)物，然后分別對(duì)PCR產(chǎn)物與載體pPIC9K進(jìn)行EcoR I和Not I雙酶切，回收，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌GT116中，篩選陽性克隆，測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒命名為pPIC9K/Alp.

1.2.3 重組畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與篩選

將重組質(zhì)粒pPIC9K/Alp采用限制性內(nèi)切酶Sac I線性化，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母KM71菌株中，然后涂布于MD平板上培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)出的酵母菌落，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［9］中酵母DNA的快速分離法提取酵母基因組，以酵母基因組為模板，以P3和P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證.

1.2.4 重組酵母在三角瓶和10 L發(fā)酵罐中的誘導(dǎo)表達(dá)

將篩選得到的陽性重組酵母菌株接種于裝有25 mL BMGY培養(yǎng)基(pH=6.0)的250 mL三角瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)直至在600 nm波長(zhǎng)下的吸光值D(600)約為5～6;然后離心收集菌體，轉(zhuǎn)接至裝有50mL BMMY培養(yǎng)基(pH=6.0)的500mL三角瓶中，每24h添加1%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集發(fā)酵上清液，采用Folin酚法測(cè)定發(fā)酵上清液中蛋白酶的酶活［10］.酶活定義如下:在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個(gè)蛋白酶活力單位.通過SDS-PAGE凝膠電泳以及Invitrogen公司的InVisionTMHis-tag In-gel Stain分析鑒定重組表達(dá)蛋白酶.

將重組酵母菌株接種于700mL YPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至D(600)約為8～10，將培養(yǎng)物接種于裝有6.3 L BSM發(fā)酵培養(yǎng)基的10 L發(fā)酵罐中培養(yǎng).培養(yǎng)過程分為3個(gè)階段:(1)甘油培養(yǎng)階段，該階段是為了讓接種后的酵母菌利用發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基迅速生長(zhǎng)，提高發(fā)酵罐中的菌體濃度，該階段溶解氧含量控制在40%水平，pH=5.0，30℃，培養(yǎng)至發(fā)酵罐中的溶解氧含量陡然上升接近100%;(2)添加甘油階段，該階段添加甘油是為菌體補(bǔ)充碳源，使其菌體濃度進(jìn)一步增加，來達(dá)到酵母菌的高密度發(fā)酵，該階段以12 mL/(L·h)的流速添加50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甘油(混有微量元素)到發(fā)酵罐中，維持?jǐn)?shù)小時(shí)，通過控制攪拌速率、通氣量和罐壓方式維持發(fā)酵罐中的溶解氧含量在20%～35%之間，停止補(bǔ)加甘油后，待發(fā)酵罐中的溶解氧含量升至接近100%，繼續(xù)維持菌體“甘油饑餓”狀態(tài)1h;(3)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段，即甲醇流加進(jìn)行誘導(dǎo)，重組蛋白酶基因位于AOX啟動(dòng)子下游，因此添加甲醇可緊密調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)AOX啟動(dòng)子啟動(dòng)，促進(jìn)外源的堿性蛋白酶基因的表達(dá)，并且由于KM71菌株中含有AOX2基因，因此KM71菌株也利用甲醇作為碳源，利于自身的生長(zhǎng)，該階段誘導(dǎo)條件為pH=6.0，28.3℃，發(fā)酵罐中的溶解氧含量維持在25% ～30%之間，甲醇流加速度逐漸提高至終速為5mL/(L·h)，定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的酶活和酵母菌體濕重.

1.2.5 重組堿性蛋白酶的純化

將發(fā)酵上清液置于截留分子質(zhì)量為6000～8000u的透析袋中，將透析袋置于飽和的PEG 10000水溶液中，4℃靜置至發(fā)酵液濃縮至原來體積的30%左右.將濃縮后的發(fā)酵液pH值調(diào)至7.4～8.0后，首先用Ni柱對(duì)重組蛋白酶進(jìn)行親和層析，層析過程中利用緩沖液A(20mmol/L磷酸鈉、0.5mol/L氯化鈉、20～40mmol/L咪唑，pH=7.4)和緩沖液 B(20 mmol/L磷酸鈉、0.5 mol/L 氯化鈉、0.5 mol/L 咪唑，pH=7.4)對(duì)Ni柱進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液.接著，用超濾離心管濃縮洗脫液，然后加樣于SephadexTMG-75凝膠柱中，采用0.05mol/L磷酸緩沖液洗脫，收集主要蛋白峰的洗脫液，再用超濾離心管濃縮收集，得到純化的蛋白酶溶液，保存?zhèn)溆?

1.2.6 重組堿性蛋白酶的酶譜試驗(yàn)

參考Till等［11］的方法進(jìn)行酶譜試驗(yàn).在酶譜試驗(yàn)中，采用12.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的分離膠(分離膠中含有0.3%酪蛋白)和5.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的濃縮膠.蛋白酶樣品與上樣緩沖液混合后直接上樣，4℃電泳.電泳后用超純水浸洗凝膠兩次，然后置于0.05mol/L甘氨酸-NaOH(pH 值為 10.0)緩沖液中，40℃酶解30min.采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色的方法對(duì)酶解后的凝膠進(jìn)行染色及脫色.

1.2.7 pH值和溫度對(duì)重組堿性蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響

將純化的重組堿性蛋白酶置于0.02 mol/L pH緩沖液中(乙酸緩沖鹽pH值為3.0～5.0，磷酸緩沖鹽 pH 值為6.0 ～7.0，Tris-HCl pH 值為 8.0 ～9.0，硼砂-氫氧化鈉pH值為9.0～11.0)，然后分別測(cè)定其酶活，以確定最適反應(yīng)pH值.將酶液置于不同的緩沖液中，25℃靜置1 h，然后于pH=10.0條件下測(cè)定其酶活，考察不同pH值對(duì)酶穩(wěn)定性的影響.

在不同的溫度(40～70℃)下進(jìn)行重組堿性蛋白酶的酶活測(cè)定，以此確定其最適反應(yīng)溫度.并在其穩(wěn)定的pH條件下，將酶液分別置于不同溫度中保溫10、20、40、60、80 和 120 min，然后測(cè)定不同溫度處理后余下的酶活，以考察溫度對(duì)重組堿性蛋白酶穩(wěn)定性的影響.

1.2.8 重組堿性蛋白酶對(duì)牛胰島素氧化B鏈的水解試驗(yàn)

參考Bakhtiar等［12］的方法，取牛胰島素氧化B鏈100μg溶解于1mL 0.02 mol/L(pH 值為9.0)乙醇胺-鹽酸緩沖液中，加入一定量酶液(約30U)，混合后放置于40℃水浴中酶解1h，沸水浴5min滅酶活.利用質(zhì)譜鑒定在胰島素B鏈上的酶切位點(diǎn).

1.2.9 重組堿性蛋白酶對(duì)大豆蛋白和花生蛋白的水解試驗(yàn)

大豆蛋白和花生蛋白的水解試驗(yàn)參考潘進(jìn)權(quán)等［13］的方法，分別用 pH 值為8.0 的0.05mol/L 磷酸鹽緩沖液配制5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的大豆分離蛋白和花生分離蛋白，然后在沸水浴中熱處理15 min.冷卻后加入酶，50℃酶解4 h，將酶解液在4000r/min下離心10min，取上清液，采用甲醛滴定法測(cè)定其水解度.采用相同的水解試驗(yàn)方法分別測(cè)定木瓜蛋白酶和Alcalase堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白和花生分離蛋白的水解效率.

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

通過提取米曲霉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用P1和P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出目的條帶;將PCR產(chǎn)物與克隆載體相連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，挑取陽性克隆測(cè)序.測(cè)序結(jié)果表明克隆的堿性蛋白酶(Alp)基因序列與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道序列(登錄號(hào):XM_001820092)完全一致，未見任何突變.

以P3和P4為引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過酶切克隆至表達(dá)載體pPIC9K上，再分別以AOX引物(5'AOX:5'GACTGGTTCCAATTGACAAGC3'和3'AOX:5'GGCAAATGGCATTCTGACATCC3')和 P3、P4 引物進(jìn)行菌落PCR，篩選出陽性克隆，測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pPIC9K/Alp構(gòu)建成功，其示意圖見圖1.

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/Alp的構(gòu)建示意圖Fig.1 Sketch of construction of recombinant expression plasmid pPIC9K/Alp

2.2 重組酵母的篩選和鑒定結(jié)果

將限制性內(nèi)切酶Sac I線性化后的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/Alp電轉(zhuǎn)至畢赤酵母KM71中，挑取在MD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的單菌落，利用G418抗生素篩選出高拷貝菌株;然后對(duì)其培養(yǎng)，提取基因組，以P3和P4引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出目的條帶(見圖2).圖2表明米曲霉堿性蛋白酶基因已成功整合至酵母基因組中.

圖2 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification of yeast transformants M—DNA 標(biāo)準(zhǔn)物，DL1000;1，2—PCR 產(chǎn)物

2.3 重組酵母在三角瓶和發(fā)酵罐中的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

外源基因在畢赤酵母中表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)在于重組蛋白表達(dá)量大，分泌至胞外直接進(jìn)入發(fā)酵液，便于分離純化.本試驗(yàn)的重組酵母菌株在三角瓶和發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，其發(fā)酵液在SDS-PAGE凝膠電泳圖譜的35ku處均有一明顯的蛋白條帶(見圖3(a)).采用Invitrogen公司的InVisionTMHis-tag In-gel Stain試劑對(duì)發(fā)酵液的SDS-PAGE凝膠染色曝光，明顯可見在考馬斯亮藍(lán)染色的35 ku處具有一白斑(見圖3(b)).該試劑只能與帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白結(jié)合，在紫外線的照射下激發(fā)產(chǎn)生熒光，形成可見的白斑.在構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，在堿性蛋白酶的C端設(shè)計(jì)增加了6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，該重組蛋白酶在紫外線照射下可形成白斑.根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)的重組堿性蛋白酶的分子質(zhì)量接近35ku;而對(duì)于整合了未帶外源基因的空表達(dá)載體pPIC9K的KM71菌株而言，其發(fā)酵液在SDS-PAGE電泳圖譜的35 ku處未見明顯的蛋白條帶(見圖3(a)).此結(jié)果表明重組堿性蛋白酶在KM71中表達(dá)成功，電泳圖譜上的35ku處的蛋白條帶是重組堿性蛋白酶條帶.

圖3 重組堿性蛋白酶的電泳圖譜Fig.3 Electrophoretic patterns of recombinant alkaline protease

圖4 重組酵母菌產(chǎn)酶及生長(zhǎng)曲線圖Fig.4 Curves of protease activities and growth versus time for recombinant P.pastoris strain

重組酵母菌產(chǎn)酶及生長(zhǎng)曲線如圖4所示.由圖4可知，在三角瓶中誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，誘導(dǎo)至96h后酵母菌濕重達(dá)到最高(約45g/L)，然后基本保持穩(wěn)定;誘導(dǎo)至120h時(shí)，發(fā)酵液的酶活最高(700U/mL).在發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，酵母菌菌體濕重可達(dá)約250g/L，顯著高于三角瓶中的濕重，誘導(dǎo)至108 h時(shí)，發(fā)酵液酶活達(dá)到4100 U/mL，顯著高于三角瓶中發(fā)酵液的酶活.酵母菌是好氧微生物，特別是在高密度發(fā)酵生長(zhǎng)時(shí)耗氧量更大;由于發(fā)酵罐具備供氧和攪拌裝置，這為酵母菌的高密度生長(zhǎng)提供了條件，因此發(fā)酵罐中的菌體濃度高于三角瓶.重組堿性蛋白酶是重組酵母菌自身分泌的胞外蛋白，酵母菌菌體越多，分泌的蛋白酶量越大，因此發(fā)酵罐中發(fā)酵液的酶活高于三角瓶中發(fā)酵液的酶活.工業(yè)上通常以麥麩或稻麩等作為培養(yǎng)基原料，采用固體發(fā)酵米曲霉生產(chǎn)堿性蛋白酶.固體發(fā)酵產(chǎn)酶量一般最高能達(dá)到1200U/g［6］，而且發(fā)酵場(chǎng)所大，存在易污染、菌體生長(zhǎng)難控制、產(chǎn)生酶種類多且不便于分離純化等不足［7］，因此，采用基因工程手段，構(gòu)建重組菌株進(jìn)行液體發(fā)酵來生產(chǎn)重組米曲霉堿性蛋白酶是一種較佳的途徑.

2.4 重組堿性蛋白酶的純化及酶譜試驗(yàn)結(jié)果

重組堿性蛋白酶僅需要幾種純化方式相結(jié)合就能從發(fā)酵液中得到純化.首先，將發(fā)酵上清液置于飽和的PEG 10000水溶液中透析，這主要是對(duì)重組堿性蛋白酶進(jìn)行濃縮以及降低發(fā)酵液的黏度，從而為層析做準(zhǔn)備.接著，通過Ni柱層析將重組蛋白酶吸附于Ni柱上，而其他大部分雜蛋白通過穿過液被分離掉;然后，對(duì)Ni柱進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液中緩沖液B含量為30%時(shí)，重組堿性蛋白酶含量最高;最后，利用SephadexTMG-75凝膠層析柱的分子篩排阻效應(yīng)，對(duì)不同分子質(zhì)量的蛋白進(jìn)行分離，得到純化的重組堿性蛋白酶.采用SDS-PAGE電泳圖譜對(duì)分離純化的樣品純度進(jìn)行比較分析(見圖3(c))，發(fā)現(xiàn)經(jīng)凝膠層析后，純化的蛋白酶在SDS-PAGE電泳圖譜中僅具有單一條帶，表明該酶已經(jīng)純化至電泳純.

將純化后的重組堿性蛋白酶進(jìn)行酶譜試驗(yàn)，電泳圖譜上清晰地顯示一條透明的水解條帶(見圖3(d))，這進(jìn)一步表明分離純化得到的蛋白是重組堿性蛋白酶.該條帶比SDS-PAGE電泳中的條帶靠后，主要是由于上樣緩沖液和凝膠中均未加SDS以及未對(duì)重組堿性蛋白酶進(jìn)行煮沸的變性處理過程，這使得該酶的表面帶電荷較少以及空間結(jié)構(gòu)未發(fā)生較大改變，因此其電泳速率較慢，水解條帶靠后.

2.5 不同pH值和溫度下重組堿性蛋白酶的活性和穩(wěn)定性

圖5給出了pH值對(duì)重組堿性蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響.由圖5結(jié)果可知:重組堿性蛋白酶的最適反應(yīng)pH值為8.5～9.5;重組堿性蛋白酶經(jīng)pH值為6.0～10.0的緩沖液處理后，pH值對(duì)其酶活影響不顯著，這表明該酶具有較好的pH穩(wěn)定性;當(dāng)pH值高于10.0或者低于5.0后，酶穩(wěn)定性明顯下降.

圖5 pH值對(duì)重組堿性蛋白酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of pH value on activity and stability of recombinant alkaline protease

圖6所示為溫度對(duì)重組堿性蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響.由圖6(a)可知，重組堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為50℃.由圖6(b)可見，該酶在低于40℃的條件下具有良好的穩(wěn)定性，當(dāng)超過45℃時(shí)，該酶會(huì)緩慢失活，一旦溫度超過55℃則極不穩(wěn)定，放置20min后活性幾乎完全喪失.

圖6 溫度對(duì)重組堿性蛋白酶活性和穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of temperature on activity and stability of recombinant alkaline protease

2.6 重組堿性蛋白酶對(duì)牛胰島素氧化B鏈的水解作用

圖7給出了重組堿性蛋白酶Alp在胰島素B鏈上的切割位點(diǎn).由圖7可知，重組堿性蛋白酶對(duì)牛胰島素氧化B鏈有8個(gè)酶切位點(diǎn)，且均比商業(yè)化的3種同家族酶(Subtilisin Novo［12］，Subtilisin BPN'［12］和枯草桿菌蛋白酶［14］)的酶切位點(diǎn)多.對(duì)酶切位點(diǎn)而言，除了在之間有共同的酶切位點(diǎn)，其余酶切位點(diǎn)均不相同.根據(jù)Tanford報(bào)道的氨基酸殘基的疏水度值計(jì)算，發(fā)現(xiàn)不同酶切位點(diǎn)末端氨基酸殘基的疏水度小于3種商品化酶的疏水度［15］，而疏水度越大的氨基酸出現(xiàn)于肽端時(shí)，對(duì)該多肽的苦味貢獻(xiàn)越大［16］.這表明了重組堿性蛋白酶廣泛的肽鍵選擇和脫苦作用.

圖7 重組堿性蛋白酶Alp在胰島素B鏈上的切割位點(diǎn)Fig.7 Cleavage points of recombinant alkaline protease on oxidized insulin B-chain

2.7 重組堿性蛋白酶對(duì)大豆蛋白和花生蛋白的水解試驗(yàn)結(jié)果

不同蛋白酶對(duì)大豆蛋白和花生蛋白的水解結(jié)果如表1所示.由表1可知，重組堿性蛋白酶對(duì)大豆蛋白和花生蛋白的水解程度均高于木瓜蛋白酶，而對(duì)花生蛋白的水解程度均高于兩種商業(yè)用酶，這表明重組堿性蛋白酶在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中具有較大的開發(fā)利用價(jià)值.

表1 不同蛋白酶對(duì)大豆蛋白和花生蛋白的水解結(jié)果Table 1 Hydrolysis results of different proteases to soy protein and peanut protein

3 結(jié)語

文中探討了米曲霉堿性蛋白酶基因的克隆，并將其在畢赤酵母KM71中成功誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)的蛋白分離純化，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)以及其對(duì)大豆和花生蛋白水解特性進(jìn)行了初步研究.以往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于霉菌產(chǎn)生蛋白酶而言，固體發(fā)酵產(chǎn)生的酶量高于液體發(fā)酵;對(duì)于米曲霉而言，固體發(fā)酵產(chǎn)酶量一般最高能達(dá)到1200U/g，在本試驗(yàn)中，重組堿性蛋白酶在10L發(fā)酵罐中的發(fā)酵液酶活達(dá)到4100 U/mL，這表明該重組堿性蛋白酶的表達(dá)量高于米曲霉中的表達(dá)量;并且該重組蛋白酶直接分泌至發(fā)酵液中，利于該酶的分離和純化.該酶具有較寬泛的pH穩(wěn)定性和較高的熱穩(wěn)定性，對(duì)大豆蛋白和花生蛋白的水解能力比商業(yè)化木瓜蛋白酶強(qiáng)，對(duì)花生蛋白的水解能力比Alcalase堿性蛋白酶強(qiáng).以上結(jié)果顯示該重組堿性蛋白酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有較大的開發(fā)潛力.

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