張衷華 王 化 劉 英 祖元?jiǎng)?/p>

(森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下所發(fā)生的主動(dòng)連續(xù)的程序化死亡過程［1］。鑒定植物細(xì)胞程序化死亡較可靠的方法為透射電子顯微鏡技術(shù)，但透射電子顯微鏡制樣復(fù)雜，尤其在原生質(zhì)體程序化死亡檢測中受到限制，所以一般常用的方法包括DNA梯狀條帶法、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶生物素dUTP缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP nick end labeling reaction，TUNNEL)、膜聯(lián)蛋白 V(Annexin V)法等。并且需要2種以上的方法結(jié)合使用。Annexin V由于能夠與程序化死亡早期細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞的早期凋亡檢測，O’Brien［2－3］較早將其應(yīng)用于植物細(xì)胞的凋亡檢測，我國學(xué)者徐昌杰［4］也應(yīng)用此法成功檢測了低氧脅迫下懸浮培養(yǎng)的蘋果細(xì)胞的程序化死亡。但到目前為止，并沒有將Annexin V應(yīng)用于鹽脅迫下原生質(zhì)體早期凋亡檢測的報(bào)道。本文應(yīng)用膜聯(lián)蛋白V－異硫氰酸熒光素(Annexin V－Fluorescein isothiocyanate，Annexin V－FITC)檢測在不同鹽脅迫下煙草原生質(zhì)體的PCD，探索Annexin V－FITC檢測法在鹽脅迫下對(duì)原生質(zhì)體PCD檢測的應(yīng)用。

1 試驗(yàn)材料

煙草(Nicotiana tabacum L.)種子播種于滅菌的培養(yǎng)皿中，并在人工氣候箱中培養(yǎng)。氣候箱設(shè)置為光照4級(jí)，相對(duì)濕度50% ～80%，溫度22℃，每天光照12 h。種子發(fā)芽后移入石英砂中，定期澆灌Hoagland 培養(yǎng)液(配方:KH2PO41 mmol·L－1，KNO35 mmol·L－1，Ca(NO3)25 mmol·L－1，MgSO42 mmol·L－1，H3BO32.86 g·L－1，MnCl2·4H2O 1.81 g·L－1，ZnSO4·7H2O 0.22 g·L－1，CuSO4·5H2O 0.08 g·L－1，H2MoO4·H2O 0.02 g·L－1，乙二胺四乙酸鐵鹽溶液)。煙草幼苗長至4對(duì)完整葉片時(shí)，取最新發(fā)育的完整葉片提取原生質(zhì)體。原生質(zhì)體緩沖提取液為CPW鹽，甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓，每10 mL緩沖液加入纖維素酶(cellulose from truchoderma Virde，Japan)0.08 g，離析酶(Macerozyme R－10，Japan)0.02 g。27℃黑暗酶解4 h，蔗糖梯度離心純化后，調(diào)節(jié)原生質(zhì)體密度為4×105個(gè)·mL－1后，保存在含10.8%甘露醇的CPW溶液中。

2 試驗(yàn)方法

配制10.8%甘露醇的CPW溶液作為溶劑，以此溶劑準(zhǔn)確配制不同濃度的鹽處理液。根據(jù)不同濃度 NaCl(50、100、150、200、300、400、500、600 mmol·L－1)處理原生質(zhì)體所表現(xiàn)出的滲透壓穩(wěn)定性和凋亡特征，確定200 mmol·L－1NaCl濃度最穩(wěn)定。為了對(duì)比同濃度不同種類鹽對(duì)原生質(zhì)體作用的差異，將CaCl2、NaHCO3和Na2CO3處理鹽濃度也設(shè)置為200 mmol·L－1，同時(shí)再根據(jù)多次鹽脅迫的作用效果，將600 mmol·L－1NaCl和 100 mmol·L－1Na2CO3作為試驗(yàn)濃度，使鹽作用效果更具有一定的梯度。最終鹽濃度設(shè)置為:0、200 mmol·L－1CaCl2，200、600 mmol·L－1NaCl，200、100 mmol·L－1NaHCO3，100、200 mmol·L－1Na2CO3。將在保存液中保存的原生質(zhì)體平均分配到10個(gè)離心管中，低速離心去上清，加入不同鹽處理液進(jìn)行處理，根據(jù)原生質(zhì)體的數(shù)量調(diào)整加入處理液的體積，確保原生質(zhì)體的濃度為(0.8 ～1.0)×105個(gè)·mL－1。

煙草原生質(zhì)體凋亡采用FITC－Annexin V(碧云天)染色法和PI雙重染色法鑒定。吸取100 μL的原生質(zhì)體鹽處理液加入Annexin V－FITC 10 μL染色5 min 后，加入 PI 5 μL，繼續(xù)染色 5 min。吸取 20 μL染色后的原生質(zhì)體溶液滴到載玻片上，直接在倒置熒光顯微鏡(Nikon TE2000)下觀察，背景熒光通過調(diào)節(jié)曝光時(shí)間去除。此處不用10.8%甘露醇的CPW溶液清洗是為了避免再次清洗造成凋亡原生質(zhì)體的破碎。

計(jì)算不同脅迫下原生質(zhì)體密度比(以正常CPW甘露醇溶液原生質(zhì)體密度為基準(zhǔn))，以獲得破碎細(xì)胞率。

破碎率=(對(duì)照溶液完整原生質(zhì)體數(shù)量－處理液完整原生質(zhì)體數(shù)量)/對(duì)照溶液完整原生質(zhì)體數(shù)量×100%;

凋亡率=處理液中凋亡原生質(zhì)體數(shù)量/處理液完整原生質(zhì)體數(shù)量;

死亡率=處理液中死亡原生質(zhì)體數(shù)量/處理液完整原生質(zhì)體數(shù)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 凋亡原生質(zhì)體的形態(tài)

Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，Annexin V不能進(jìn)入正常細(xì)胞的細(xì)胞膜，所以，正常的細(xì)胞不能被著色。細(xì)胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，因此Annexin V是檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。當(dāng)Annexin V被熒光FITC標(biāo)記時(shí)，細(xì)胞膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸與Annexin V－FITC結(jié)合，在藍(lán)色光激發(fā)下，可發(fā)出綠色的熒光。圖1為200 mmol·L－1NaCl脅迫下煙草原生質(zhì)體的特征。由圖1可見，Annexin V著色的細(xì)胞(綠色熒光)形態(tài)大致分為3個(gè)連續(xù)的過程:箭頭1所示的細(xì)胞內(nèi)葉綠體比較均勻地分布于原生質(zhì)體內(nèi)，細(xì)胞膜綠色熒光明顯，同時(shí)細(xì)胞核不能被PI著色;箭頭2所示的細(xì)胞中，葉綠體不是均勻地分布于細(xì)胞內(nèi)，而是聚集到細(xì)胞內(nèi)的一側(cè)，細(xì)胞膜綠色熒光明顯，此時(shí)細(xì)胞核沒有被PI著色;在箭頭3所示的細(xì)胞中，細(xì)胞圓形形態(tài)被破壞，葉綠體部分翻向細(xì)胞膜外側(cè)，此時(shí)，細(xì)胞核被PI輕微著色。在觀察中發(fā)現(xiàn)，Annexin V染色顯示的細(xì)胞凋亡過程為連續(xù)的過程，尤其是葉綠體向細(xì)胞內(nèi)一側(cè)運(yùn)動(dòng)時(shí)，也存在一定比例的不能被Annexin V－FITC著色的細(xì)胞和著色較淺的細(xì)胞。雖然凋亡的原生質(zhì)體與正?；盍Φ脑|(zhì)體存在一定的形態(tài)學(xué)上的差異，但僅從形態(tài)學(xué)上很難將其準(zhǔn)確區(qū)分。

圖1 200 mmol·L－1NaCl脅迫下煙草原生質(zhì)體 FITC－Annexin V染色結(jié)果

3.2 不同鹽處理下原生質(zhì)體的凋亡、死亡與破碎

不同鹽處理的原生質(zhì)體在5 h時(shí)表現(xiàn)出最大的FITC－Annexin V著色，結(jié)果如圖2和表1。用10.8%甘露醇溶液作為對(duì)照，煙草原生質(zhì)體存在一定的膨脹，以及4.54%的凋亡率和16.67%的死亡率。當(dāng)保存液中加入200 mmol·L－1的 CaCl2、NaCl或NaHCO3時(shí)，細(xì)胞保持正常的膨壓，這樣有利于降低膨壓對(duì)原生質(zhì)體的影響。當(dāng)原生質(zhì)體用200 mmol·L－1的CaCl2溶液處理時(shí)，凋亡率為3.03%、死亡率為1.51%，兩者都較對(duì)照有明顯的下降，細(xì)胞破碎率低于0.01%。當(dāng)用200 mmol·L－1的 NaCl處理時(shí)，凋亡率為7.57%、死亡率為16.67%，較對(duì)照和CaCl2溶液中原生質(zhì)體的凋亡率和死亡率存在顯著的上升，但細(xì)胞破碎率沒有明顯的增加。

圖2 不同鹽溶液處理煙草原生質(zhì)體的凋亡、死亡與破碎狀況

在600 mmol·L－1NaCl溶液中，原生質(zhì)體顯著收縮，細(xì)胞破碎率顯著上升，達(dá)到18.18%;凋亡率和死亡率分別為1.85%和7.41%，較200 mmol·L－1NaCl處理下凋亡率和死亡率顯著下降，這主要是由于原生質(zhì)體失水收縮、活力下降和破碎導(dǎo)致凋亡率和死亡率相對(duì)減少。當(dāng)原生質(zhì)體處于堿性鹽(200、100 mmol·L－1NaHCO3和 100、200 mmol·L－1Na2CO3)脅迫時(shí)，細(xì)胞的破碎率顯著上升，表明堿性鹽對(duì)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性存在較大的傷害。200 mmol·L－1NaHCO3溶液中，煙草的原生質(zhì)體存在較多FITCAnnexin V著色的細(xì)胞，大約為10.34%，但同時(shí)PI也有不同程度的著色。200 mmol·L－1NaHCO3溶液中，凋亡原生質(zhì)體以能激發(fā)出綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)量計(jì)算。分析兩種鹽脅作用可知，NaHCO3(200 mmol·L－1)和中性鹽(200 mmol·L－1NaCl)脅迫對(duì)原生質(zhì)體形態(tài)特征的影響存在明顯的差異，原生質(zhì)體內(nèi)葉綠體并沒有運(yùn)動(dòng)出完整的細(xì)胞膜，但細(xì)胞核PI著色卻很明顯(圖2，e)，表明NaHCO3使細(xì)胞膜的透性發(fā)生了改變。葉電解質(zhì)滲漏率研究也表明，堿性鹽較大程度地改變了細(xì)胞膜的滲透性［5－8］。

表1 不同鹽溶液處理煙草原生質(zhì)體的凋亡、死亡和破碎結(jié)果

4 結(jié)論與討論

細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)的程序化死亡過程，正常生長或正常培養(yǎng)的細(xì)胞也存在一定比例的細(xì)胞凋亡，所以外來脅迫是否會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在200 mmol·L－1NaCl脅迫下，Lin 等［9］通過檢測亞二倍體細(xì)胞(Sub－G1 cells)測得煙草原生質(zhì)體的程序化死亡率約為14%。本試驗(yàn)采用Annexin V和PI染色結(jié)合的方法測得200 mmol·L－1NaCl脅迫下煙草原生質(zhì)體的凋亡率為7.57%，明顯低于Lin等［9］的檢測結(jié)果，一方面是由于處理時(shí)間差異，另一方面也表明Annexin V方法在原生質(zhì)體早期檢測中比較靈敏。由于植物細(xì)胞膜的穩(wěn)定性不如細(xì)胞核，所以隨著處理時(shí)間的延長，細(xì)胞核凋亡檢測方法更適合發(fā)生凋亡細(xì)胞量的統(tǒng)計(jì)。細(xì)胞膜的完整性決定著外來脅迫作用的部位，決定著細(xì)胞作為植物基本的生命單位所發(fā)生的生命活動(dòng)過程，在凋亡檢測中，細(xì)胞膜的功能性和完整性必須檢測，所以結(jié)合細(xì)胞膜和細(xì)胞核凋亡的檢測更能得出客觀的結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)，堿性鹽(NaHCO3和Na2CO3)能夠?qū)е录?xì)胞膜滲透率的增加，使部分PI染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使細(xì)胞核著色，所以，Annexin V和PI染色結(jié)合的方法會(huì)明顯低估原生質(zhì)體的凋亡率，甚至檢測不到原生質(zhì)體凋亡，在應(yīng)用此法檢測細(xì)胞膜透性增大的原生質(zhì)體凋亡時(shí)，一定要結(jié)合Annexin V著色原生質(zhì)體的形態(tài)進(jìn)行區(qū)別。

鹽脅迫除了能誘導(dǎo)原生質(zhì)體凋亡外，也能導(dǎo)致原生質(zhì)體的死亡和破碎。Horváth［10］應(yīng)用 100 mmol·L－1NaCl處理馬鈴薯葉片原生質(zhì)體5 h的結(jié)果表明，55% ～60%的原生質(zhì)體存在活力。Rizkalla［11］應(yīng)用不同濃度的NaCl脅迫棕櫚原生質(zhì)體的試驗(yàn)表明，隨著NaCl濃度的增加，原生質(zhì)體數(shù)量減少，在200 mmol·L－1NaCl脅迫下，原生質(zhì)體數(shù)量為對(duì)照的一半。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在200 mmol·L－1NaCl脅迫5 h下，原生質(zhì)體的破碎率只有0.14%，這是因?yàn)樵|(zhì)體的滲透壓穩(wěn)定性是在200 mmol·L－1NaCl溶液中確定的，所以處理過程中，降低了由于滲透壓變化造成的原生質(zhì)體破碎。此外，原生質(zhì)體的凋亡和破碎還與原生質(zhì)體的濃度和純度密切相關(guān)。

本研究的結(jié)果表明:Annexin V與PI染色結(jié)合的方法在定量化原生質(zhì)體凋亡率時(shí)，應(yīng)該與核凋亡的檢測方法結(jié)合使用，但在檢測膜滲透性改變的原生質(zhì)體凋亡時(shí)應(yīng)該慎重，避免凋亡結(jié)果出現(xiàn)低估。

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