孫 倩 楊 玲 沈海龍 李玉花 黃 劍

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)是木犀科白蠟樹屬大喬木樹種，主要分布于我國東北，是著名的東北“三大硬闊”之一的優(yōu)質(zhì)用材樹種。在水曲柳體胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，利用合子胚為外植體可以誘導(dǎo)產(chǎn)生水曲柳體胚［1－3］，但產(chǎn)生體胚過程中伴隨著外植體的褐化現(xiàn)象，發(fā)生體胚的外植體基本上都處于褐化狀態(tài)，而且褐化外植體上誘導(dǎo)出的體胚長勢良好［4］。進一步研究證實，水曲柳體胚發(fā)生與外植體褐化的伴隨關(guān)系較固定，誘導(dǎo)產(chǎn)生的褐化有利于其體胚發(fā)生［5－6］。褐化是指外植體或培養(yǎng)材料接種后，在組織培養(yǎng)過程中由于切割造成機械損傷，傷口處分泌出酚類化合物，在有氧的條件下，切面細胞中的酚類物質(zhì)由多酚氧化酶催化氧化為醌，醌再通過非酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)而導(dǎo)致組織褐變，變成棕褐色或暗褐色，并逐漸擴散到培養(yǎng)基中，抑制細胞內(nèi)其它酶的活性，影響細胞的正常代謝，毒害整個組織，甚至導(dǎo)致組織死亡;尤其是木本植物組織的外植體，褐變死亡是其培養(yǎng)難度較大的主要因素［7－9］，因而大部分組織培養(yǎng)過程都需要抑制外植體的褐化。李官德等［10］的研究提到，棉花的褐化且生長緩慢的愈傷組織能分化出體胚，并再生成植株。藍桉體胚發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑并不能顯著降低外植體的褐化程度，但使用降低褐化程度的抗氧化劑則可抑制體胚的發(fā)生，同時降低了多酚的積聚［11］，認為多酚的積聚在體胚發(fā)生中具有一定作用，只是這種作用尚不為人知。有研究發(fā)現(xiàn)，水曲柳體胚發(fā)生過程中的外植體褐化比棉花［10］和藍桉［11］的表現(xiàn)更加明顯，因此在由合子胚子葉為外植體誘導(dǎo)水曲柳體胚產(chǎn)生的過程中伴隨著外植體的褐化，被視為一個很普遍的現(xiàn)象。但這種現(xiàn)象與絕大多數(shù)植物組織培養(yǎng)中外植體褐化的效應(yīng)相反。因此本研究試圖揭示水曲柳體胚發(fā)生中外植體褐化與體胚發(fā)生的關(guān)系，并根據(jù)已有的研究從DNA甲基化修飾、細胞程序性死亡(PCD)和生理生化檢測等多個角度探索這個現(xiàn)象的機理和應(yīng)用技術(shù)。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)在植物細胞中以游離態(tài)和束縛態(tài)兩種形式存在［12］，是褐化過程中的主要酶類。因PPO的專一性，不會對酚類以外的物質(zhì)作用，性質(zhì)相對柔和，能夠引起植物組織的褐化，因此，設(shè)想利用在培養(yǎng)基中加入PPO來誘導(dǎo)外植體發(fā)生褐化，從而促進體胚發(fā)生。本研究通過在液體培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的PPO，利用其脅迫作用促使外植體褐化，探究PPO對水曲柳體胚發(fā)生和外植體褐化及體胚發(fā)生的影響，為揭示水曲柳體胚發(fā)生過程中外植體褐化與體胚發(fā)生的關(guān)系提供依據(jù)和研究借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料采集與處理

水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)未成熟種子和成熟種子分別于2010年7月下旬和9月下旬取自東北林業(yè)大學(xué)哈爾濱實驗林場內(nèi)生長良好的40～60年生水曲柳母樹;各母樹均為自由授粉，母樹之間距離大于50 m;各母樹采集相同數(shù)目種子后充分混合再取樣用于試驗。

未成熟外植體處理:剝除外種皮后用自來水沖洗24 h，用75%乙醇浸泡1 min后，再用2%次氯酸鈉溶液消毒15 min，在超凈工作臺上用無菌水沖洗5次;剝?nèi)〕鰡纹尤~，并使子葉近軸面接觸培養(yǎng)基接種。

成熟外植體處理:剝除外種皮后用自來水浸泡48 h(定時換水并用攪拌器攪拌)之后再用自來水沖洗12 h;用75%乙醇浸泡1 min后，再用10%的次氯酸鈉消毒20 min，在超凈工作臺上用無菌水沖洗5次;在超凈工作臺上剝?nèi)〕鰡纹尤~，并使子葉近軸面接觸培養(yǎng)基接種。

1.2 體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)

體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為雙培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基+液體培養(yǎng)基，即用滅菌藥匙在固體培養(yǎng)基表面挖出直徑約1 cm的凹面，然后在凹面內(nèi)加入0.1 mL的液體培養(yǎng)基)。固體和液體培養(yǎng)基均為MS 1/2(MS基本培養(yǎng)基中所有成分均減半)附加1.5 mg·L－1NAA、0.5 mg·L－1BA、70 g·L－1蔗糖、400 mg·L－1水解酪蛋白。固體培養(yǎng)基加7.5 g·L－1瓊脂固化。培養(yǎng)基的pH值在高壓滅菌前調(diào)至5.8。接種后用封口膜將培養(yǎng)皿封口，于25℃下暗培養(yǎng)。培養(yǎng)室的相對濕度為40%～60%。

1.3 PPO 處理

多酚氧化酶(PPO)處理:用液體培養(yǎng)基配制不同處理質(zhì)量濃度的PPO溶液。其中:未成熟外植體分別用 1、15、25、50、100、150 mg·L－1的 PPO 浸泡;成熟外植體分別用 15、25、50、100、150 mg·L－1的PPO浸泡。處理方法:用過濾滅菌器(孔徑0.22 μm)將PPO溶液過濾后加到固體培養(yǎng)基上的凹面內(nèi)，每凹面內(nèi)0.1 mL。以不添加PPO溶液的液體培養(yǎng)基為對照。每個處理質(zhì)量濃度重復(fù)5次，每個重復(fù)接種10片子葉外植體。每天用顯微鏡觀察并在培養(yǎng)的第5、10、30、60天時統(tǒng)計外植體生長、褐化情況和體胚發(fā)生情況。第10天褐化外植體的統(tǒng)計標準:肉眼能夠觀察到外植體表面1/4以上褐化，即視為外植體褐化(30 d時外植體均已基本褐化，60 d時均深度褐化)。

1.4 外植體PPO、POD和CAT的活性測定

利用前期試驗確定的褐化和體胚發(fā)生均最佳的50 mg·L－1的PPO處理進行重復(fù)培養(yǎng)試驗，對培養(yǎng)15 d時的外植體提取樣品，用于PPO、POD和CAT酶活性測定。

PPO活性的測定:取0.25 g的試驗材料及0.4 g的 PVP，冰浴研磨，并用 2.5 mL、0.1 mol·L－1、pH為6.8的檸檬酸磷酸緩沖溶液稀釋，在4℃、10000 r·min－1的條件下離心15 min，取上清液用于酶活測定。在4 mL的酶活測定體系中含有:2.9 mL、pH為6.8 的檸檬酸磷酸緩沖溶液，1 mL、0.1 mol·L－1鄰苯二酚及0.1 mL的酶液。測定398 nm處的OD值。

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POD活性的測定:取0.3 g試驗材料并加入5 mL、0.1 mol·L－1、pH 為 7.8 的磷酸緩沖溶液進行冰浴研磨，后置于4℃、10 000 r·min－1條件下離心20 min，取上清液用于酶活測定。在4 mL的反應(yīng)體系中含有:1 mL、pH 為7.0的磷酸緩沖溶液，0.95 mL、0.2% 的愈創(chuàng)木粉，2 mL、0.2%H2O2及 0.05 mL酶液。在470 nm下記錄OD值。

CAT活性的測定:取0.3 g試驗材料并加入5 mL、0.1 mol/L、pH 為7.8 的磷酸緩沖溶液進行冰浴研磨，后置于4℃、10 000 r·min－1條件下離心 20 min，取上清液用于酶活測定。在3 mL的反應(yīng)體系中含有:1 mL 0.2%的 H2O2，1.9 mL、pH 為 7.0 的磷酸緩沖溶液及0.1 mL酶液。在240 nm下記錄OD值。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)均為各重復(fù)處理的平均數(shù)±標準差。標準差由每個試驗的5個重復(fù)處理計算得出。采用單因子方差分析評價試驗中各影響因子的作用，并在P=0.05水平上進行差異顯著性檢驗。平均數(shù)間統(tǒng)計學(xué)差異用鄧肯多重比較法在P=0.01或0.05顯著性水平上檢驗。計算公式為:

外植體生長率=有生長現(xiàn)象的外植體個數(shù)×100/接種存活的外植體總數(shù)%;

第10天外植體褐化率=培養(yǎng)第10天褐化的外植體個數(shù)×100/接種存活的外植體總數(shù)%;

第10天褐化外植體體胚發(fā)生率=在培養(yǎng)第10天時褐化且在培養(yǎng)第60天時發(fā)生體胚的外植體數(shù)量×100/具有生理活性的外植體總數(shù)%;

第10天未褐化外植體體胚發(fā)生率=在培養(yǎng)第10天時褐化且在培養(yǎng)第60天時發(fā)生體胚的外植體數(shù)量×100/具有生理活性的外植體總數(shù)%;

體胚發(fā)生率=培養(yǎng)第60天時產(chǎn)生體胚的外植體個數(shù)×100/具有生理活性的外植體總數(shù)%;

第10天褐化外植體體胚比重=在培養(yǎng)第10天時褐化且在培養(yǎng)第60天時發(fā)生體胚的外植體數(shù)量×100/培養(yǎng)第60天時的發(fā)生體胚的外植體數(shù)量%;

第10天褐化外植體體胚比率=在培養(yǎng)第10天時褐化且在培養(yǎng)第60天時發(fā)生體胚的外植體數(shù)量×100/培養(yǎng)第10天時褐化的外植體數(shù)量%。

2 結(jié)果與分析

2.1 水曲柳體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)中外植體的變化

在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，未成熟外植體(圖1A)從接種后3 d開始略微增大，外植體顏色從切口處和邊緣向內(nèi)逐漸由乳白變成淡黃色，隨著外植體的生長，其表面略有褐色斑(圖1B)，10 d以后外植體表面部分變?yōu)楹稚疑厦嬗写罅康挠鷤M織產(chǎn)生;培養(yǎng)20 d后，在褐化部位愈傷組織的量明顯增加，在褐變部位有少量體胚產(chǎn)生，多為半透明狀球型胚(圖1C);培養(yǎng)30 d后，體胚數(shù)量明顯增加，體胚顏色由半透明變?yōu)槿榘咨?，此時體胚形態(tài)多為心型胚(圖1D)和魚雷型胚(圖1E)，及少數(shù)體胚簇(圖1F)。40 d后可以觀察到子葉型胚(圖1G)。長體胚的外植體的褐化程度比沒長體胚的外植體的深，且長有體胚的外植體都是褐化的。這些長有體胚的褐化外植體，在用鑷子夾取時，能夠明顯地感受到該外植體具有活細胞脆性和彈性，這與一般意義上的外植體褐變致死后的松軟或干硬的失活狀態(tài)完全不同。

成熟外植體接種后經(jīng)過12 d靜止期后開始生長，第15天開始略微增大，隨后外植體顏色等外觀變化與未成熟外植體相似。

2.2 PPO處理對水曲柳未成熟外植體褐化與體胚發(fā)生的影響

PPO處理的水曲柳未成熟外植體從接種后3 d開始略微增大，外植體顏色從切口處和邊緣向內(nèi)逐漸由乳白變成淡黃色(圖1H)，褐變比對照早，且體胚的產(chǎn)生都伴有外植體的褐化。添加外源PPO對水曲柳未成熟外植體的生長影響不大(未顯示數(shù)據(jù))，其中只有質(zhì)量濃度為50 mg·L－1的PPO顯著抑制了培養(yǎng)初期外植體的生長(P＜0.05)。

由于培養(yǎng)30 d后外植體均已基本褐化，培養(yǎng)60 d后外植體均已深度褐化，所以取培養(yǎng)10 d的外植體褐化狀況進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)果見表1。除了100 mg·L－1質(zhì)量濃度的處理褐化值偏低(等于對照的)外，培養(yǎng)基中添加PPO均促進水曲柳外植體的褐化，總體上比對照的褐化率高出13.4%。其中:PPO質(zhì)量濃度為50 mg·L－1時外植體褐化率最大，高于其它處理及對照，培養(yǎng)第10天時其褐化率達到50%，比對照高出26.7%，差異達顯著性程度(P＜0.05)。相應(yīng)地，培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為50 mg·L－1PPO處理的體胚發(fā)生率也最高，高于其它處理和對照，達到40.0%，比對照高出16.7%，差異顯著(P＜0.05)。各PPO處理的體胚發(fā)生率雖然差異較大，有的甚至低于對照，但從培養(yǎng)第10天的褐化外植體中發(fā)生體胚外植體占全部發(fā)生體胚外植體的比重來看，PPO加快褐化進程的同時也明顯促進體胚發(fā)生，因為所有PPO處理在第10天褐化外植體上發(fā)生的比重均高于對照，總體上高出18.3%。其中:褐化率和體胚發(fā)生率最高的50 mg·L－1PPO處理的比重達到58.3%，高出對照29.7%;第10天褐化外植體體胚比率數(shù)據(jù)也說明了50 mg·L－1PPO處理的促進效果，其培養(yǎng)第10天時褐化的外植體中在第60天時發(fā)生體胚的外植體數(shù)量占到了培養(yǎng)第10天時褐化的外植體數(shù)量的46.7%，高出對照18.1%。除了25 mg·L－1的PPO處理外，其余處理的培養(yǎng)第10天時褐化外植體體胚發(fā)生率均高于對照。其中:50 mg·L－1的PPO處理高于其他處理和對照，并與對照的差異達到顯著性程度(P＜0.05)。而各處理及對照的10 d未褐化外植體體胚發(fā)生率差異很小，未達差異顯著水平(P＞0.05)，說明PPO處理在加快外植體褐化進程的同時對其體胚發(fā)生也具有促進作用。

2.3 PPO處理對成熟外植體褐化與體胚發(fā)生的影響

PPO處理的水曲柳成熟外植體的變化與未成熟外植體一樣，但需要經(jīng)過12 d左右的靜止期后狀態(tài) 才能發(fā)生改變。

圖1 PPO處理條件下水曲柳未成熟外植體和體胚發(fā)生狀態(tài)

表2結(jié)果顯示，添加一定質(zhì)量濃度的PPO會促進水曲柳成熟外植體的生長(培養(yǎng)第15天)，但不同質(zhì)量濃度的促進效果不同。其中:50 mg·L－1的PPO處理對外植體的生長抑制作用比較明顯，但差異未達顯著水平(P＞0.05)。添加一定質(zhì)量濃度的PPO會加快水曲柳成熟外植體的褐化進程。其中:50 mg·L－1的PPO處理培養(yǎng)第15天時褐化率達到40.0%，與對照差異顯著(P ＜0.05);50.0 mg·L－1的PPO處理培養(yǎng)第60天時體胚發(fā)生率雖然高于其他處理和對照，但差異未達顯著水平(P＞0.05)。

2.4 水曲柳未成熟外植體PPO、POD和CAT的活性比較

選取在褐化及體胚發(fā)生中現(xiàn)象最為明顯的PPO質(zhì)量濃度為50.0 mg·L－1處理的未成熟水曲柳外植體，與同一時間(培養(yǎng)第15天)培養(yǎng)的對照同時進行PPO、POD和CAT活性測定及比較(此時外植體的生長狀態(tài)處于體胚發(fā)生前期)，結(jié)果如表3。表3結(jié)果顯示:在體胚發(fā)生前期，經(jīng)PPO處理的外植體內(nèi)的POD活性顯著低于對照;CAT活性低于對照，但差異不顯著;PPO活性高于對照，但差異不顯著。

表1 不同質(zhì)量濃度PPO處理下水曲柳未成熟外植體褐化與體胚發(fā)生狀況 %

表2 PPO處理對水曲柳成熟外植體生長、褐化和體胚發(fā)生的影響

表3 體胚發(fā)生前期水曲柳未成熟外植體PPO、POD和CAT活性

3 結(jié)論與討論

3.1 水曲柳體胚發(fā)生過程中外植體的褐化現(xiàn)象

水曲柳體胚發(fā)生過程中伴隨著外植體的褐化現(xiàn)象，發(fā)生體胚的外植體基本上都處于褐化狀態(tài)，而且褐化外植體上誘導(dǎo)出的體胚長勢良好［3－4］，體胚發(fā)生與外植體褐化的伴隨關(guān)系較固定。誘導(dǎo)產(chǎn)生褐化有利于外植體的體胚發(fā)生［5－6］。本研究進一步證明褐化進程不一致:PPO處理的外植體褐化進程快，體胚發(fā)生率高;對照褐化進程慢，體胚發(fā)生率低。但是在培養(yǎng)30 d后發(fā)生體胚的外植體基本上都是褐化的，而且試驗中還發(fā)現(xiàn)，這些發(fā)生體胚的外植體具有活細胞的脆性和彈性。試驗結(jié)果與一般意義上組織培養(yǎng)中的褐變表現(xiàn)不一樣:植物組織培養(yǎng)中所說的褐化，是指在外植體誘導(dǎo)初分化或再分化過程中自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，以至培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象;褐化產(chǎn)物不僅使外植體、細胞、培養(yǎng)基褐變，而且對許多酶有抑制作用，影響培養(yǎng)材料的生長與分化，嚴重時甚至導(dǎo)致材料死亡［7－9］。深入解析水曲柳中這種特殊現(xiàn)象的產(chǎn)生機理，不僅可能為解析樹木體胚發(fā)生機理找到新的標記和明顯的切入點，也可能為解析植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的機理找到新的途徑。因此，這種現(xiàn)象值得從形態(tài)解剖學(xué)、生理學(xué)、細胞生物學(xué)和分子遺傳學(xué)等多種角度深入研究。

3.2 PPO處理可以促進水曲柳外植體褐化進程并提高體胚發(fā)生率

本研究結(jié)果說明:50 mg·L－1的PPO處理，可以顯著促進水曲柳未成熟外植體的褐化進程(培養(yǎng)第10天外植體褐化率顯著高于對照和其他PPO質(zhì)量濃度處理)，相應(yīng)地顯著提高了其體胚發(fā)生率(總的體胚發(fā)生率和培養(yǎng)10 d時褐化外植體的體胚發(fā)生率均顯著高于對照和其他PPO質(zhì)量濃度處理)。總體上，經(jīng)PPO處理的外植體，其培養(yǎng)10 d時外植體的褐化率、總的體胚發(fā)生率、培養(yǎng)10 d褐化外植體體胚比重及比率、褐化外植體體胚發(fā)生率，均與對照有顯著差異，只有培養(yǎng)10 d的未褐化外植體體胚發(fā)生率與對照差異不顯著。對于水曲柳成熟外植體，50 mg·L－1的PPO處理也顯著促進了外植體的褐化進程，雖然體胚發(fā)生率高于其他處理和對照，但差異未達顯著水平。在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的5－氮胞苷的試驗發(fā)現(xiàn)［6］:抑制外植體褐化的處理質(zhì)量濃度同樣抑制了體胚發(fā)生;而對外植體褐化抑制程度最低的質(zhì)量濃度處理，其體胚發(fā)生率也最高;不同質(zhì)量濃度對外植體褐化的作用趨勢與對體胚發(fā)生率的影響趨勢相同;在不同時間加入5－氮胞苷，顯著抑制外植體褐化的同時也明顯地抑制了體胚的發(fā)生。這與藍桉體胚發(fā)生中“使用降低褐化程度的抗氧化劑則抑制了體胚的發(fā)生”的結(jié)果一致［11］，與本研究結(jié)果的趨勢相反，但都說明了同一個問題:即促進褐化則提高體胚發(fā)生率，抑制褐化則降低體胚發(fā)生率。此外，李官德等［10］的研究提到:棉花的褐化且生長緩慢的愈傷組織能分化出體胚，并再生成植株，這與本研究的結(jié)果一致:50 mg·L－1的PPO處理顯著抑制了水曲柳未成熟和成熟外植體的生長，但其外植體褐化率和體胚發(fā)生率均最高。

3.3 PPO處理促進褐化進程并進而提高體胚發(fā)生率的可能機理

本研究發(fā)現(xiàn)，在體胚發(fā)生前期，經(jīng)PPO處理的外植體內(nèi)的POD活性顯著低于對照，雖然差異不顯著，但CAT活性低于對照，PPO活性高于對照。前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，褐化的外植體中的POD酶活性均顯著低于未褐化的外植體，而且只要發(fā)生愈傷組織或體胚的外植體，其POD酶活性就降低;褐化發(fā)生愈傷組織和褐化發(fā)生體胚的外植體中CAT酶活性極低。POD是植物防御中的第一道防線，POD和PPO共同氧化酚成醌，醌轉(zhuǎn)變成縮合型鞣質(zhì)，最后形成褐色［13］。當植物體受到機械損傷時，受傷部位會產(chǎn)生系統(tǒng)素，經(jīng)過十八烷酸途徑最后合成茉莉酸，再進一步合成寡聚半乳糖醛酸，通過外用誘導(dǎo)物的激發(fā)和活性氧的迸發(fā)作用，使H2O2產(chǎn)生并作為第二信使誘導(dǎo)防御基因合成相關(guān)防御蛋白，從而提高PPO活性;PPO再與酚類物質(zhì)作用，出現(xiàn)外植體的褐化現(xiàn)象［14－17］。因此，水曲柳外植體褐化的過程可能是:當水曲柳的合子胚被切割后造成了一定的機械損傷，使得細胞產(chǎn)生大量的酚類等物質(zhì)，傷口處分泌出酚類化合物，切面細胞中的酚類物質(zhì)由外界的PPO催化，氧化為醌，醌再通過非酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)而導(dǎo)致組織褐變;由于加入PPO的外植體一直處在含有PPO和產(chǎn)物醌的脅迫中，因此細胞內(nèi)的褐化進程加快、褐化程度持續(xù)加深，促進胚性細胞周圍細胞發(fā)生程序化死亡，從而促進胚性細胞向體細胞胚的轉(zhuǎn)化速度、提高其轉(zhuǎn)化率;而由于程序化死亡，POD和CAT的酶的溢出可能受到限制，酶活性降低。然而，對于PPO處理促進外植體褐化進程并提高體胚發(fā)生率的機制，本項研究還不能提供確切的證據(jù)，需要進一步深入研究。

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