石中強(qiáng)，徐 艷，王樹迎*，黃麗波，侯衍猛，張德敏，劉 宵

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，泰安271018;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，泰安 271018)

促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)是由腺垂體分泌的兩種糖蛋白激素，其作用主要是通過促卵泡素受體(FSHR)和促黃體素受體(LHR)兩種特異性受體介導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的。FSHR和LHR均屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的糖蛋白亞家族成員，兩種受體的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)有高度同源性，二者都具有7個(gè)跨膜區(qū)，4個(gè)胞質(zhì)區(qū)以及由3個(gè)環(huán)狀區(qū)和N端組成的細(xì)胞外區(qū)，都是由α和β兩個(gè)亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合而成的異二聚體，功能的特異性取決于α鏈和β鏈的聯(lián)合作用［1］。FSHR和LHR對(duì)動(dòng)物的生殖發(fā)育調(diào)控既有拮抗又有協(xié)同的作用。FSHR和LHR在結(jié)構(gòu)和功能上的這些特點(diǎn)引起廣大學(xué)者對(duì)其分布和功能的變化很大的關(guān)注。

近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH和LH除了影響傳統(tǒng)的性腺靶位點(diǎn)外，在性腺外組織也存在其受體的分布。在人、豬、牛和小鼠等的輸卵管、子宮中均已發(fā)現(xiàn)存在有LHR［2］，F(xiàn)SHR在子宮肌層和子宮頸上存在也已被證實(shí)［2］，而有關(guān)山羊生殖道內(nèi)FSHR和LHR的研究報(bào)道較少。沂蒙黑山羊是山東省地方優(yōu)良品種，屬絨、毛、肉兼用型，以體格大，肉質(zhì)好，產(chǎn)絨量高而著稱，但其繁殖率低，產(chǎn)羔平均為110%［3］，因此提高其繁殖率對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展具有非常重要的意義。本試驗(yàn)運(yùn)用RT－PCR技術(shù)研究沂蒙黑山羊發(fā)情周期子宮中FSHR和LHR基因子宮不同部位的表達(dá)規(guī)律，為探討黑山羊繁殖力的生殖內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)理提供一些分子水平上的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取臨床健康、體重25 kg左右、年齡2～3歲的空懷沂蒙黑山羊24只，通過試情、觀察外部變化、B超檢察，確定沂蒙黑山羊的發(fā)情周期約為17～19 d。分別選取處于發(fā)情前期(－3～－2)、發(fā)情期(0～1)、發(fā)情后期(3～5)、間情期(9～12)的母羊各6只，采取動(dòng)脈放血，剖開腹腔迅速取出子宮，分別取子宮角、子宮肉阜、子宮體和子宮頸置于液氮中保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 焦磷酸二乙酯(美國sigma公司)，Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit、熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM(TAKARA)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國sigma公司)，紫外分光光度計(jì)(Eppendorf)，Eppendorf PCR儀，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上山羊FSHR的cDNA序列(EU847288)，LHR基因(NM174381)和持家基因GAPDH(AJ431207)，在各自的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異的熒光定量PCR引物，三種引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

1.3 子宮四段總RNA的提取與定量

分別取50～100 mg凍存的每段子宮組織，用DEPC水配制的PBS洗滌，研缽中研磨，收集研粉，用TRIZOL法提取總RNA。用紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度及純度，A260/A280=1.8～2.0時(shí)，所得RNA－70℃保存。將所提取總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見所提取總RNA效果較好(圖1)。

1.4 cDNA 合成

取1μg總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT)18為引物，反轉(zhuǎn)錄體系20 μL，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄的cDNA于－20℃保存。

表1 FSHR、LHR和GAPDH基因的引物序列Table 1 Primers sequences of FSHR，LHR，and GAPDH genes

圖1 總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Gel electrophoresis of total RNA

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用熒光定量試劑盒，在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析，以熔解曲線無非特異性峰和CT值在18～35之間為標(biāo)準(zhǔn)，分別確定了擴(kuò)增條件:擴(kuò)增體系20 μL時(shí)上下游引物各為0.4 μL，cDNA 模板為2 μL。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

隨機(jī)等量采集不同發(fā)情時(shí)期子宮不同部位的cDNA，充分混勻作為標(biāo)準(zhǔn)品，以2倍濃度梯度進(jìn)行倍比稀釋5個(gè)稀釋度，采用優(yōu)化好的條件進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)稀釋度三個(gè)平行樣，分別制作FSHR、LHR和GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在ABI 7500熒光定量PCR儀上擴(kuò)增并檢測熒光。20 μL PCR體系中含SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，0.2 μmol/L FSHR、LHR和GAPDH的上下游引物，cDNA模板2 μL。擴(kuò)增參數(shù)為:兩步法第一步95℃30 s，第二步95℃5 s、60℃34 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束進(jìn)行熔解曲線的測定，反應(yīng)條件:95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s。三種基因均設(shè)定空白對(duì)照(無擴(kuò)增模板cDNA)。

1.8 數(shù)據(jù)的處理

用相對(duì)定量的研究方法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)算表達(dá)水平比率2－△△CT。

利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物特異性

熒光定量PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析(見圖2、3、4)表明，PCR擴(kuò)增的目的條帶大小與預(yù)期相吻合，而且沒有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，說明擴(kuò)增特異性很強(qiáng)，產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

熒光定量PCR結(jié)束后對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，標(biāo)準(zhǔn)品的cDNA倍比稀釋進(jìn)行擴(kuò)增后得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為:FSHR(圖5);LHR(圖6);GAPDH(圖7)。已標(biāo)明相關(guān)系數(shù)、斜率兩個(gè)參數(shù)?？梢娤嚓P(guān)系數(shù)r2均 ＞0.99，斜率均在 －3.5～ －3.1，擴(kuò)增效率接近100%，定量結(jié)果可靠。

2.3 熔解曲線和擴(kuò)增曲線

經(jīng)過熔解曲線測定(圖8)，得到了子宮各段組織FSHR、LHR和GAPDH特異性的單峰擴(kuò)增產(chǎn)物，其Tm值分別為FSHR:81.7℃，LHR:82.1℃，GAPDH:85.8℃;無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物;空白對(duì)照無擴(kuò)增，定量準(zhǔn)確。

擴(kuò)增曲線(圖9)說明三種目的基因的擴(kuò)增線性良好，且熒光閾值在PCR擴(kuò)增的對(duì)數(shù)期，CT值適中;空白對(duì)照反應(yīng)孔只見背景熒光，并無擴(kuò)增的熒光響應(yīng)即無CT值，說明定量準(zhǔn)確。

圖9 擴(kuò)增曲線:A:GAPDH，B:FSHR，C:LHRFig.9 Delta Rn vs Cycle:A:GAPDH，B:FSHR，C:LHR

2.4 FSHRmRNA、LHRmRNA在發(fā)情周期子宮中的表達(dá)水平

表2，3可見:沂蒙黑山羊子宮各段中FSHRmRNA和LHRmRNA在發(fā)情周期的各階段均有表達(dá)。

子宮角在發(fā)情后期FSHRmRNA表達(dá)量最高，各時(shí)期之間差異顯著(P＜0.05);子宮肉阜在間情期表達(dá)量最高，四時(shí)期之間差異不顯著(P＞0.05);子宮體的表達(dá)量同比最低且差異性規(guī)律與子宮頸相似;在子宮頸，發(fā)情期的表達(dá)量最高且與其它時(shí)期之間差異顯著(P＜0.05)，間情期同發(fā)情前期、發(fā)情后期之間也差異顯著(P ＜0.05)。

表2 發(fā)情周期四時(shí)期子宮內(nèi)FSHR的表達(dá)水平Table 2 The levels of FSHR expression in uterine of four estrous cycle phases

表3 發(fā)情周期四時(shí)期子宮內(nèi)LHR的表達(dá)水平Table 3 The levels of LHR expression in uterine of four estrous cycle phases

子宮各部位均在間情期LHRmRNA表達(dá)量最高。子宮角和子宮肉阜在間情期LHRmRNA的表達(dá)量同其它時(shí)期之間差異顯著(P＜0.05);子宮體在發(fā)情后期、間情期分別和發(fā)情前期、發(fā)情期之間差異顯著(P＜0.05);子宮頸在發(fā)情周期各時(shí)期之間均差異顯著(P＜0.05)。

整體上FSHRmRNA的表達(dá)水平均比LHRmRNA高，在子宮頸，發(fā)情周期四時(shí)期FSHRmRNA的表達(dá)量均極顯著(P＜0.01)高于LHRmRNA。

3 討論

3.1 關(guān)于FSHRmRNA在子宮中的表達(dá)規(guī)律及介導(dǎo)子宮功能調(diào)節(jié)中的作用

在本研究中，發(fā)情后期子宮角的FSHRmRNA表達(dá)量最高，與其它三個(gè)時(shí)期差異顯著，這一點(diǎn)與濟(jì)寧青山羊的研究結(jié)果［4］一致。有研究發(fā)現(xiàn)人的FSH能誘導(dǎo)催乳素的產(chǎn)生促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞向蛻膜細(xì)胞轉(zhuǎn)變［5］，發(fā)情后期子宮內(nèi)膜可能要發(fā)生向妊娠階段的轉(zhuǎn)化(在人稱蛻膜化)，沂蒙黑山羊發(fā)情后期子宮角FSHRmRNA的高表達(dá)對(duì)子宮妊娠的準(zhǔn)備起調(diào)控作用。本試驗(yàn)間情期子宮肉阜FSHRmRNA的表達(dá)量最高的同時(shí)，LHRmRNA的表達(dá)水平也達(dá)到最高，筆者推測此時(shí)FSHR和LHR基因胚胎著床和妊娠準(zhǔn)備有協(xié)同作用。FSHRmRNA在子宮角和子宮肉阜表達(dá)峰值的時(shí)期并不相同，有研究表明:牛、綿羊等的早期胚胎在附植以前有一段比較長的游離生活期;在豬的發(fā)情后期子宮角尖端發(fā)現(xiàn)胚胎，以后胚胎進(jìn)入子宮體，然后胚胎分布附植結(jié)束;綿羊胚胎附植的完成也是在交配期即發(fā)情期后14 d左右［6］，可見子宮角FSHRmRNA表達(dá)的峰值早于子宮肉阜，可能與早期胚胎在子宮角內(nèi)遷移的位置有關(guān)。

子宮體在妊娠初期胚胎在子宮內(nèi)的遷移中起輔助作用［6］。本試驗(yàn)中，子宮體FSHRmRNA的表達(dá)量最低，其表達(dá)規(guī)律與子宮頸相似。

在魏軍強(qiáng)［4］的研究結(jié)果中，濟(jì)寧青山羊子宮頸在發(fā)情前期和發(fā)情期FSHRmRNA的表達(dá)量最高，在發(fā)情期達(dá)到峰值，與本研究結(jié)果相同，且子宮頸FSHRmRNA的表達(dá)量變化特點(diǎn)與外周血漿中FSH的濃度變化趨勢一致［7，8］。D.Mizrachi等［9］的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動(dòng)情前期和動(dòng)情期牛子宮頸中FSHR的表達(dá)量高于其他時(shí)期;當(dāng)外周血漿FSH達(dá)到高峰時(shí)，F(xiàn)SHR的表達(dá)量最高。此外，Shemesh.M等［10］的研究也發(fā)現(xiàn)，牛子宮頸組織中存在FSHR及其mRNA的表達(dá)，且排卵期FSHR的表達(dá)達(dá)到高峰。因此推測山羊在發(fā)情前期至發(fā)情期時(shí)外周血高水平FSH通過作用于子宮頸，產(chǎn)生高水平FSHRmRNA的表達(dá)，進(jìn)而增加前列腺素表達(dá)使子宮頸松弛張開。在發(fā)情后期，F(xiàn)SHRmRNA的表達(dá)量開始下降，至間情期持續(xù)下降，此時(shí)外周血的雌激素水平也下降，孕酮水平上升［7，8］導(dǎo)致子宮頸催產(chǎn)素受體表達(dá)量的降低［11］，子宮頸開始緊縮，此時(shí)FSH對(duì)子宮頸的作用開始減弱。間情期時(shí)FSHRmRNA的表達(dá)量最低，此時(shí)FSH對(duì)子宮頸的作用可能已經(jīng)很小。

在子宮角和子宮肉阜FSHRmRNA的表達(dá)規(guī)律與子宮體和子宮頸不同，說明FSH對(duì)子宮前段和對(duì)子宮后段功能的調(diào)節(jié)相對(duì)獨(dú)立。具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.2 關(guān)于LHRmRNA在子宮中的表達(dá)規(guī)律及介導(dǎo)子宮功能調(diào)節(jié)中的作用

人、豬、牛、小鼠等［2］和山羊［12］子宮內(nèi)都存在LHR。在濟(jì)寧青山羊的子宮發(fā)情期LHRmRNA表達(dá)量最低，間情期最高［12］，與本研究結(jié)果相同。本試驗(yàn)子宮不同部位在間情期LHRmRNA的表達(dá)量達(dá)到峰值，而后漸漸降低，至發(fā)情期排卵前后達(dá)到最低值。在豬子宮肌層［13］，牛子宮內(nèi)膜［14］、子宮肌層和子宮頸［10］，兔和鼠［15］的研究結(jié)果也有相近的表達(dá)規(guī)律。一方面，子宮中LHRmRNA的表達(dá)在黃體期達(dá)到峰值可使LH結(jié)合位點(diǎn)和cAMP的水平增加，cAMP和磷脂酶C兩條途徑都被LH激活，在發(fā)情周期每個(gè)階段LH對(duì)兩條途徑的作用都與組織中LHR的表達(dá)量相關(guān)。有研究表明，子宮肌層中的LHR主要的生理功能是刺激其發(fā)育和增生，以及子宮活力的舒張［16］，其高表達(dá)作用可能是維持黃體期子宮的靜止?fàn)顟B(tài)，以利于早期妊娠［17］。另一方面，子宮中LHRmRNA表達(dá)量的變化與COX2和PGF產(chǎn)物的誘導(dǎo)作用之間有一定程度的相關(guān)性［18，19］，LH使黃體期子宮內(nèi)膜LHR的表達(dá)量達(dá)到峰值，促進(jìn)了子宮內(nèi)膜中COX2和PGF2α的分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)黃體的溶解，為卵泡期降低LH對(duì)子宮的作用做了準(zhǔn)備，這一點(diǎn)與體外注射PGF2α后黃體中LH結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量降低的結(jié)果［20］相吻合。但在牛的子宮靜脈，LHR及其mRNA在發(fā)情前期至發(fā)情期的表達(dá)水平最高［10］，推測LH使LHR活化增加PGF2α的合成，通過反向逆流機(jī)制到達(dá)黃體，加快黃體溶解［21］。隨后因?yàn)闆]有受精卵的形成，黃體的漸漸溶解，LHRmRNA的表達(dá)量也隨之下降，直至發(fā)情期達(dá)到最低，此時(shí)LHR對(duì)子宮的作用已較弱。

3.3 FSHRmRNA和LHRmRNA在子宮中的表達(dá)規(guī)律與子宮功能調(diào)節(jié)的關(guān)系

有研究表明子宮的調(diào)控可能需要FSH和LH同時(shí)起作用，F(xiàn)SH濃度的變化對(duì)LHR基因的表達(dá)也有影響［22］。本研究中整體上FSHRmRNA表達(dá)水平均比LHRmRNA高，特別是子宮頸，已達(dá)到極顯著水平的差異，子宮前段FSHRmRNA和LHRmRNA的表達(dá)在發(fā)情后期或間情期達(dá)到峰值，而子宮后段在發(fā)情期FSHRmRNA的表達(dá)量最高，同時(shí)LHRmRNA最低，在間情期LHRmRNA的表達(dá)量最高，同時(shí)FSHRmRNA最低，結(jié)合外周血中FSH和LH濃度的變化規(guī)律［7，8］，筆者發(fā)現(xiàn)FSH和LH對(duì)子宮前段的作用是相互協(xié)同，由LH起主導(dǎo)作用，對(duì)子宮后段的作用是相互拮抗，由FSH起主導(dǎo)作用;而且在人的作用閾值的研究［23］中FSH起作用的表達(dá)閾值較高，LH閾值較低，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，F(xiàn)SHR和LHR在發(fā)情周期不同時(shí)期子宮不同部位中的表達(dá)量并不相同，即對(duì)子宮的調(diào)控作用也不同。主要有對(duì)胚胎著床及妊娠的準(zhǔn)備，子宮頸開放的控制，對(duì)黃體的生成和溶解的作用等等。盡管已在人類、多種哺乳類、貓、小鼠、兔和火雞生殖道內(nèi)發(fā)現(xiàn)有LHR，但在反芻動(dòng)物生殖道發(fā)現(xiàn)LHR的存在可能更為重要。反芻動(dòng)物的黃體溶解受子宮調(diào)控，子宮內(nèi)自分泌－旁分泌調(diào)節(jié)是調(diào)控黃體溶解的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。弄清這些作用機(jī)制，能夠?yàn)樯窖虻纳硟?nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)理提供一定的理論依據(jù)，為提高山羊繁殖率的研究提供部分基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)保護(hù)地方品種具有十分重要的意義。

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