王 鵬，安 靜，，侯 蕾，孔祥強(qiáng)，，趙彥修，張 慧*

(1.山東師范大學(xué)、山東省逆境植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250014;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濟(jì)南 250100)

鹽脅迫條件首先對植物產(chǎn)生滲透脅迫，植物可以通過增加吸收無機(jī)離子來對抗?jié)B透脅迫，但是隨著無機(jī)離子特別是Na+的大量積累又產(chǎn)生了離子毒害。為了能在鹽脅迫環(huán)境中生存，植物的一個重要策略就是降低植物細(xì)胞質(zhì)中的Na+含量，建立新的離子穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞水平上，離子穩(wěn)態(tài)的建立主要包括兩方面:Na+的外排和Na+的區(qū)隔化［1］。位于液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (NHX)通過質(zhì)子泵水解ATP供能，將胞質(zhì)中的Na+區(qū)隔化至液泡，以消除Na+的毒害，同時(shí)促進(jìn)K+的高親和性吸收［2］，在鹽脅迫下對植物細(xì)胞維持穩(wěn)定的pH值和離子穩(wěn)態(tài)起到重要的作用［3］。

擬南芥、水稻、冰葉日中花等多個物種中的液泡膜NHXs相繼被克?。?］。擬南芥AtNHX1在擬南芥［5］、番茄［6］、棉花［7］中的過量表達(dá)，均提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性［8］，而通過基因敲除等方法使NHXs活性降低則導(dǎo)致植株耐鹽性降低［9］，證實(shí)了其在植物耐鹽性中的重要作用。擬南芥AtNHX1的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，但上調(diào)幅度不明顯［10］，而冰葉日中花［11］和甜菜 (Beta vulgaris L.)［4］中的NHXs基因則能明顯被鹽脅迫誘導(dǎo)，同時(shí)其表達(dá)受ABA誘導(dǎo)途徑中的MYB轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)［12］。Garbarino J等［13］證實(shí)甜菜液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在鹽誘導(dǎo)條件下表達(dá)量升高，轉(zhuǎn)運(yùn)活力增強(qiáng)。這些結(jié)果顯示了鹽生植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鹽機(jī)制中的重要性。過量表達(dá)甜土植物擬南芥［5］、大豆［14］、水稻［15］和鹽生植物堿蓬和鹽芥 (引用加上李維煥和高秀華發(fā)表的文章)等的NHXs基因都不同程度提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。但是對于甜菜BvNHX1基因的研究卻很少。

甜菜是一種中度耐鹽的植物，1985年Blumwald等第一次從耐鹽植物甜菜的根部貯藏組織液泡膜上發(fā)現(xiàn)了Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性［16］。Xia等獲得了編碼BvNHX1的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)鹽處理能夠提高BvNHX1在整株水平上的表達(dá)量，同時(shí)能夠提高BvNHX1蛋白表達(dá)量和Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)活性。酵母互補(bǔ)試驗(yàn)證明它能恢復(fù)酵母突變體 (Dena1–4Dnhx1)液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性［4］。本研究從甜菜cDNA中克隆得到BvNHX1基因，利用植物表達(dá)載體pROKII將BvNHX1基因在擬南芥中過量表達(dá)，篩選獲得了過量表達(dá)BvNHX1基因擬南芥的純合轉(zhuǎn)化子，對其進(jìn)行了分子鑒定和耐鹽性分析，探討B(tài)vNHX1在植物耐鹽中的作用。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和植物

載體pYES2、植物表達(dá)載體pROKⅡ、大腸桿菌 (Escherichia coli)DH5α菌株、農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)GV3101菌株、擬南芥 (Arabidopsis thaliana)Columbia生態(tài)型種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。載體pGEM－T Easy Vector購于Promega公司。

1.2 酶與試劑

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)用各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶和Ex taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，生化試劑購自Sigma公司或國產(chǎn)分析純。所用DNA引物由上海生工公司合成，用到的引物序列為:BvNHX1F:5＇－ATGAGTTTCTGAGGGTCTGG－3＇;BvNHX1R:5＇－ATATTCTGTCTATCAAATTTTCGG－3＇。

1.3 BvNHX1基因的克隆和植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以甜菜cDNA作模板，使用BvNHX1F和BvNHX1R引物通過RT－PCR擴(kuò)增得甜菜BvNHX1基因，克隆到pGEM－T Easy載體 (由本實(shí)驗(yàn)室張荃老師構(gòu)建，未發(fā)表)中。用NotI酶切pGEM－BvNHX1和中間載體pYES2質(zhì)粒，回收片段，將目的基因片段連入pYES2載體，構(gòu)建成pYES2－BvNHX1載體。用位于BvNHX1基因577 bp位置的BstXI酶切檢測pYES2－BvNHX1中BvNHX1的插入方向，用KpnI和XbaI雙酶切pYES2－BvNHX1基因反向插入 (BstXI酶切檢測反向插入的pYES2－BvNHX1可切出約1200 bp的條帶)的質(zhì)粒和pROKⅡ質(zhì)粒，將帶有KpnI/XbaI粘性末端的目的片段連入pROKⅡ載體，最終構(gòu)建成為植物表達(dá)載體pROKⅡ－BvNHX1。

1.4 擬南芥轉(zhuǎn)化及Southern和Northern雜交鑒定

通過凍融法將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，用花侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。將收獲的T0代種子播種在添加40 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選抗性苗，單株收取種子，后代經(jīng)自交最終獲得T3代穩(wěn)定遺傳的純合轉(zhuǎn)基因植株，用于轉(zhuǎn)基因株系的Southern和Northern雜交鑒定。提取部分轉(zhuǎn)BvNHX1基因的純系和野生型擬南芥的基因組DNA，用HindⅢ酶切擬南芥基因組DNA，以BvNHX1基因全長片段為探針模板進(jìn)行Southern雜交。提取部分轉(zhuǎn)BvNHX1基因的純系和野生型擬南芥的總RNA，以BvNHX1基因全長片段為探針模板進(jìn)行Nouthern雜交。雜交膜以磷屏 (Kodak)壓膜24 h，Typhoon 8600(Molecu-lar Dynamics)掃描磷屏獲得雜交結(jié)果及信號數(shù)據(jù)。

1.5 過量表達(dá)株系的耐鹽性分析

1.5.1 鹽脅迫下種子萌發(fā)率測定方法 種子消毒除菌后重懸于滅菌水中，用槍吸取種子均勻播種在含有150 mM NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，每皿播種100粒。4℃層積3 d后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率，以有兩片綠色子葉為準(zhǔn)。

1.5.2 擬南芥成苗的鹽處理方法 擬南芥種子播種于育苗介質(zhì):蛭石:珍珠巖 (4:3:1)的混合介質(zhì)中，培養(yǎng)條件是:光照16 h，溫度18℃，濕度60%;黑暗8 h，溫度22℃，濕度60%。擬南芥生長到4周時(shí)，選取長勢一致的幼苗，分別用不同濃度NaCl溶液進(jìn)行澆灌處理，對照澆灌Hogland營養(yǎng)液。NaCl的濃度逐漸增加，每次遞加50 mM直到終濃度，每隔1 d處理1次，達(dá)到處理終濃度后，再繼續(xù)處理14 d。每次澆灌量為培養(yǎng)基質(zhì)持水量的3倍，以保持盆中處理液濃度的恒定。觀察各株系的生長情況并拍照。

1.5.3 干、鮮重的測量 將信封編號，放于烘箱中烘干至恒重，記錄信封的重量。收取植株地上部分葉片，用蒸餾水沖洗干凈，用吸水紙吸干表面水分，迅速裝入對應(yīng)信封中，測每個重復(fù)的信封和鮮重的和。之后放入烘箱中，120℃烘烤30 min，再轉(zhuǎn)為80℃烘烤48 h至恒重，稱量信封和干重的和。計(jì)算單株地上部分的干重和鮮重。每個株系做3個重復(fù)，每個重復(fù)包含5棵植株。

1.6 Na+、K+離子含量的測定方法

取葉片120℃殺青30 min，于80℃的烘箱烘干2 d，取烘干的材料100 mg于坩堝內(nèi)，放入馬福爐中300℃ 2 h然后560℃ 10 h進(jìn)行灰化處理，冷卻后取出，加入一定量的硝化液 (由1mL 60%三氯乙酸，5 mL濃硝酸和0.5 mL濃硫酸混合而成)，于90℃恒溫水浴中保溫10 min?？瞻讓φ諡榧尤氲攘肯趸旱碾p蒸水。12000 rpm離心12 min，取上清液。稀釋一定的倍數(shù)，用火焰分光光度計(jì)Flame Photometer 410(Z－8000，Hitachi，Tokyo，Japan) 測定Na+和K+離子的含量［17］。每個分析樣本取5株進(jìn)行測定，重復(fù)3次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 BvNHX1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切驗(yàn)證

將pGEM－－BvNHX1、中間載體pYES2－BvNHX1和植物表達(dá)載體pROKⅡ－BvNHX1分別用合適的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切檢測，圖1為載體構(gòu)建過程的酶切驗(yàn)證結(jié)果，可見pROKⅡ－BvNHX1和pGEMBvNHX1質(zhì)粒能酶切出同等長度的目的基因條帶 (圖1中箭頭所指的位置為目的基因條帶)，證明BvNHX1基因表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 擬南芥轉(zhuǎn)化及抗性植株分子鑒定

用農(nóng)桿菌花侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了pROKⅡ－BvNHX1的轉(zhuǎn)化植株。選取6個轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Southern雜交分析 (圖2 A)，以野生型植株的DNA作對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中都出現(xiàn)了陽性雜交信號，對照沒有雜交信號，這表明基因的確已經(jīng)整合到擬南芥的基因組中，而T－DNA插入的拷貝數(shù)不等。對同樣的6個轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Northern雜交分析 (圖2 B)，檢測轉(zhuǎn)基因植株中BvNHX1基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明BvNHX1基因在擬南芥中正常轉(zhuǎn)錄，野生型擬南芥沒有雜交信號。不同轉(zhuǎn)基因擬南芥植株雜交信號強(qiáng)弱不同，表明不同株系BvNHX1的表達(dá)量不同，其中b30－3、b19－6、b11－23株系表達(dá)水平較高。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性分析

為研究BvNHX1轉(zhuǎn)基因擬南芥在高鹽條件下的脅迫抗性，將分子鑒定為陽性并且BvNHX1表達(dá)量較高的b30－3、b11－23 T3代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行耐鹽性分析。

2.3.1 轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫條件下的種子萌發(fā)情況 為了檢測過量表達(dá)BvNHX1基因能否提高轉(zhuǎn)基因植株在萌發(fā)期的耐鹽性將野生型和BvNHX1轉(zhuǎn)基因株系b30－3的種子分別播種在含有150 mM NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，此后每天計(jì)算種子的萌發(fā)率。如圖3，b30－3比野生型種子萌發(fā)早，培養(yǎng)4 d的時(shí)候野生型只有極少數(shù)種子萌發(fā)，而b30－3萌發(fā)率達(dá)到大約16%，此后BvNHX1轉(zhuǎn)基因株系b30－3每天的萌發(fā)率均比野生型明顯升高。說明過量表達(dá)BvNHX1基因提高了鹽脅迫下擬南芥種子的萌發(fā)率。(最好加上吧b11－23的數(shù)據(jù))

2.3.2 轉(zhuǎn)基因植株在不同鹽脅迫處理下的生長情況 將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥播種于混合介質(zhì)中，生長4周后，分別用0、100、125、150、和200mM NaCl處理。處理2周后發(fā)現(xiàn)，在0 mM NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因植株 (b30－3)的生長與對照植株沒有明顯的差異。而在NaCl脅迫下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的生長均受到影響，處理鹽濃度越高對植株的影響越大。150、200 mM NaCl處理下的野生型生長受抑制、葉片發(fā)黃，而轉(zhuǎn)基因株系受到的影響相對較小 (圖4)。結(jié)果說明過量表達(dá)BvNHX1基因明顯提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。同時(shí)，別的轉(zhuǎn)基因株系的表型與b30－3相似，所以本圖中只提供了b30－3株系的表型圖。

2.3.3 鹽處理對轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株鮮重和干重的影響 鹽脅迫對植物生長的影響主要體現(xiàn)在地上部分的干重和鮮重的降低。我們對鹽脅迫后野生型和轉(zhuǎn)基因株系的鮮干重測定后發(fā)現(xiàn)，與0 mM NaCl條件下相比，各種濃度鹽處理下的植株鮮重和干重均下降，且隨著處理鹽濃度的升高降幅增大。與鹽處理表型一致的是，轉(zhuǎn)基因植株葉片的鮮重和干重在不同鹽濃度下高于野生型對照，尤其200 mM NaCl處理下，兩個轉(zhuǎn)基因株系的鮮重和干重都顯著高于野生型對照 (圖5)。

2.4 鹽脅迫對野生型和轉(zhuǎn)基因植株中Na+、K+離子含量的影響

液泡膜Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將Na+運(yùn)送到液泡中，為了驗(yàn)證BvNHX1的表達(dá)是否影響擬南芥中Na+和K+的積累，對野生型和轉(zhuǎn)基因株系中Na+和K+含量進(jìn)行檢測。0 mM NaCl條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系中Na+和K+的含量基本沒有差別，隨著鹽濃度的升高，野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片中的Na+離子含量均持續(xù)增加而K+離子含量持續(xù)減少。但與野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因植株地上部分的Na+(圖6 A)和K+(圖6B)含量都相對較高，且150 mM NaCl處理下轉(zhuǎn)基因株系的K+含量比野生型顯著升高。結(jié)果表明，表達(dá)BvNHX1基因促進(jìn)了鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株對K+的吸收，這與其在高鹽條件下較好的生長趨勢是一致的。

3 結(jié)論與討論

在鹽脅迫環(huán)境中，植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能將胞質(zhì)中的Na+區(qū)隔化至液泡中，以避免過多的Na+干擾細(xì)胞內(nèi)正常的生理生化代謝，從而有利于植物在鹽漬化土壤中生存。過量表達(dá)NHX基因能明顯提高植物的耐鹽性［5］。

在甜土植物擬南芥和番茄中均有多種基因編碼NHX，而其表達(dá)水平均較低。通過對比甜土植物擬南芥和鹽生植物鹽芥Thellungiella halophila的基因表達(dá)差異性，證明耐鹽性不同的物種之間脅迫相關(guān)基因和離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平存在差異［18，19］。甜菜［4］中的NHX基因顯著被鹽脅迫誘導(dǎo)，而在擬南芥中其鹽誘導(dǎo)幅度不明顯。這些結(jié)果顯示鹽生植物和甜土植物中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在基因表達(dá)模式上存在差異，暗示在耐鹽的功能方面也存在很大差異。另外，Xia等人認(rèn)為耐鹽植物和鹽敏感植物中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性是有差別的［4］。本研究從甜菜cDNA中克隆得到BvNHX1基因，通過轉(zhuǎn)化擬南芥來探討它在耐鹽中的作用。耐鹽性分析實(shí)驗(yàn)表明:轉(zhuǎn)基因植株能更好的適應(yīng)鹽脅迫，保持良好的長勢。不同鹽濃度條件下，轉(zhuǎn)基因株系的鮮重、干重均相對高于野生型植株。表達(dá)BvNHX1基因促進(jìn)了鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株對K+的吸收，進(jìn)一步證明了過量表達(dá)BvNHX1能促進(jìn)K+的吸收和有效利用［2］，這與其在高鹽條件下較好的生長趨勢是一致的。鹽脅迫條件下，K+的積累對植物耐鹽性非常重要，鹽脅迫下保持高的K+/Na+比有利于植物對抗鹽脅迫，我們的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)BvNHX1基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥K+/Na+比 (數(shù)據(jù)未提供)，并提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。過量表達(dá)BvNHX1基因提高擬南芥的耐鹽性與葉片中K+升高可能具有很大的關(guān)系。轉(zhuǎn)基因株系葉片中Na+和K+含量的升高可能是由于過量表達(dá)BvNHX1基因使液泡中的Na+和K+含量升高所導(dǎo)致，我們將進(jìn)一步分析液泡中Na+和K+含量，進(jìn)一步明確過量表達(dá)BvNHX1對擬南芥耐鹽性的影響。

總之，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)BvNHX1基因提高了鹽脅迫轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率、鮮、干重，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長，提高了葉片中的Na+、K+含量和K+/Na+比，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

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