杜令倩 楊丕山 趙寧 葛少華

（1.山東大學(xué)口腔醫(yī)院 牙周科；2.山東大學(xué)第二醫(yī)院 牙周科；3.山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點實驗室，濟南 250012）

牙周炎可導(dǎo)致牙周附著喪失、牙槽骨破壞和吸收。牙周病治療的主要目標是獲得牙周組織再生[1]。牙周組織再生性治療的效果很大程度上依賴于病損局部殘留的牙周再生性細胞的數(shù)量和質(zhì)量，然而由于長期慢性炎癥的影響，病損區(qū)域牙周再生性細胞的數(shù)量不足、功能不佳。如何獲取足夠的牙周再生性細胞是牙周病治療的關(guān)鍵[2]。從人牙周膜組織中分離的人牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）具有自我更新的能力并有多向分化潛能，在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下能分化為成牙骨質(zhì)樣細胞、成骨細胞、脂肪細胞和膠原形成細胞，并且在動物牙周缺損模型中能夠引起牙周膜組織的再生和牙槽骨高度的恢復(fù)[2-3]，因而被認為是牙周組織再生的主要功能細胞。

牙周組織再生過程的關(guān)鍵是有足夠量的功能細胞遷移到組織缺損區(qū)域，發(fā)揮干細胞作用，重建牙周組織。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是目前在牙周組織再生工程中研究和應(yīng)用最多的多肽生長因子之一[4]。其能夠促進牙周膜細胞的增殖及胞外基質(zhì)蛋白的合成，能夠促進牙周膜干細胞的成骨分化和骨形成[5]，誘導(dǎo)牙槽骨再生。目前關(guān)于BMP-2對PDLSCs的趨化效應(yīng)卻知之甚少。為此，本研究旨在觀察人PDLSCs對BMP-2的趨化反應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Hyclone公司，美國），Ⅰ型膠原酶、DispaseⅡ、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），雙抗、PBS液、地塞米松、維生素C、β-磷酸甘油鈉、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、牛胰島素（上海Solarbio生物科技有限公司），70μm篩網(wǎng)（Falcon公司，美國），波形絲蛋白抗體、角蛋白抗體（武漢博士德生物工程有限公司），5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）（Sigma-Aldrich，St Louis，MO，美國），BrdU抗體、BMP-2（Santa Cruz公司，美國），F(xiàn)ITC熒光標記二抗、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（北京中杉金橋生物科技有限公司），各型號培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、凍存管、離心管（Corning Costar公司，美國），其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。

GBB16CO2紫外清潔型培養(yǎng)箱（Heraeus公司，德國），DL-CJ-IN型高性能超凈工作臺（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)公司），IXZ-ILL100型倒置相差顯微鏡、OLYMPUS熒光顯微鏡和成像系統(tǒng)（OLYMPUS公司，日本）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離和培養(yǎng)人PDLSCs 標本的取得遵守世界醫(yī)學(xué)協(xié)會WMA《赫爾辛基宣言》所闡述的原則，經(jīng)山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，并獲取患者及監(jiān)護人的知情同意。標本取自臨床上12～14歲因正畸治療而拔除的牙周健康、無齲的新鮮前磨牙，刮取根中1/3的牙周膜組織，移入離心管中，加入3 g·L-1Ⅰ型膠原酶和4g·L-1DispaseⅡ輕輕振蕩，37℃下消化1h，通過70μm篩網(wǎng)獲得單個離散的細胞。將細胞密度調(diào)整為每毫升1×104個，接種于含高糖DMEM培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基中含10%FBS、2mmol·L-1L-谷氨酰胺、l00U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。3 d后換入新鮮培養(yǎng)液，以去除未貼壁的細胞，以后每2 d換液一次。取對數(shù)生長期的第一代細胞，調(diào)整細胞密度為每毫升10～15個，吹打混勻后接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，培養(yǎng)12 h后標記單個細胞孔并補液至每孔200μL，5 d后換液，待克隆長至孔底1/3～1/2后胰酶消化，擴大培養(yǎng)。

1.2.2 免疫熒光染色鑒定人PDLSCs的來源 將傳代后的人PDLSCs細胞爬片后進行免疫熒光染色。4%多聚甲醛室溫固定30min，10%山羊血清37℃封閉30min后分別滴加適量稀釋后的鼠抗人角蛋白（1∶400）、鼠抗人波形絲蛋白（1∶400）、鼠抗人STRO-1單克隆抗體（1∶500），以PBS代替一抗作陰性對照，置于濕盒中4℃過夜。次日在37℃，避光孵育lh，加入FITC熒光標記二抗，避光孵育1 h，并用5μg·mL-1DAPI復(fù)染核5min，檢測角蛋白、波形絲蛋白和STRO-1的表達，由于現(xiàn)在未發(fā)現(xiàn)PDLSCs特異表面標志物，目前干細胞表面抗原STRO-1被用來分離和鑒定PDLSCs[6]。

1.2.3 PDLSCs多向分化能力的檢測 將細胞以密度為每孔8×103個接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入成骨誘導(dǎo)劑（0.1 μmol·L-1地塞米松、50mg·L-1維生素C、10mmol·L-1β-磷酸甘油鈉）或成脂誘導(dǎo)劑（0.25μmol·L-1地塞米松、50μmol·L-1吲哚美辛、0.5mmol·L-1IBMX、10mg·L-1牛胰島素），對照組為不含誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基。每周換液2次，4周后分別用茜素紅鈣鹽染色法及油紅O染色法來測定PDLSCs的多向分化能力。

1.2.4 PDLSCs克隆形成能力及增殖活性的檢測 為檢測PDLSCs的克隆形成能力，將傳代后的PDLSCs以密度為每孔1 000個細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)10 d后，PBS沖洗2次，100%甲醇固定5min后，0.1%Toluidine blue染色，多于50個細胞的細胞集落為一個克隆。

為檢測PDLSCs的增殖狀態(tài)，將傳代后的PDLSCs按每毫升3×104個接種于含蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，當細胞長至60%融合時，換液后每孔各加入10μg·mL-1BrdU，孵育24 h后收集細胞進行BrdU的免疫化學(xué)染色。BrdU為胸腺嘧啶的衍生物，它可代替胸腺嘧啶參與DNA的合成，其摻入的多少可直接反應(yīng)細胞的增殖狀況。4%多聚甲醛室溫固定30min，2mol·L-1的鹽酸37℃孵育30min，10%山羊血清37℃封閉30min后，分別滴加適量稀釋后的鼠抗人BrdU單克隆抗體（1∶500），以PBS代替一抗作陰性對照，置于濕盒中4℃過夜。次日在37℃，避光孵育1h，加入FITC熒光標記二抗，避光孵育1 h，并用5μg·mL-1DAPI復(fù)染核5min，檢測BrdU的陽性細胞占總細胞數(shù)的比例，每組實驗重復(fù)4次。

1.2.5 細胞趨化實驗 用多聚碳酸膜上有8μm微孔的24孔Transwell細胞培養(yǎng)室來檢測PDLSCs對BMP-2的趨化反應(yīng)[7]。將第3代PDLSCs調(diào)至每毫升5×105個，在細胞培養(yǎng)室的上腔分別加入200μL細胞懸液（含0.01%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基），實驗組的下腔分別加入終濃度為100、200 ng·mL-1BMP-2的含0.01%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基500μL?？瞻讓φ战M下腔中加入含0.01%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基500μL。為證實細胞的遷移效應(yīng)是由于BMP-2的趨化效應(yīng)而非細胞的化學(xué)運動，消除細胞培養(yǎng)室上下腔中BMP-2的濃度梯度，上下腔中所用培養(yǎng)液均含有200 ng·mL-1BMP-2。所有樣本均設(shè)有復(fù)孔。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。20 h后用4%多聚甲醛室固定濾膜上下表面附著的細胞20min，用棉簽輕輕拭去濾膜上表面的細胞后PBS沖洗。伊紅染色濾膜3min，PBS沖洗3次。待濾膜干燥后，采用盲法計數(shù)，在倒置相差顯微鏡下，計已遷移至濾膜下側(cè)面的細胞數(shù)，每個濾膜隨機觀察6個不重疊的高倍視野，每組實驗重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料統(tǒng)計結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDLSCs的分離和純化

本實驗中原代培養(yǎng)的牙周膜組織來源的細胞形成相互黏附的克隆細胞簇（圖1），傳代后的PDLSCs呈典型的長梭形，卵圓形細胞核包括2或3個核仁，部分細胞核有明顯的分裂相（圖2）。

2.2 PDLSCs的鑒定

免疫熒光染色可見，PDLSCs角蛋白呈陰性表達，波形絲蛋白呈陽性表達（圖3A），說明本實驗中克隆化細胞為中胚層來源的間充質(zhì)細胞且無外胚層來源的細胞污染。免疫熒光染色證實克隆細胞STRO-1呈陽性表達，細胞發(fā)出明亮的紅色熒光，細胞核發(fā)出藍色熒光（圖3B），說明細胞有干細胞特性。

2.3 PDLSCs向成骨細胞和成脂細胞分化

PDLSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4周后，茜素紅鈣鹽染色顯示紅色的礦化結(jié)節(jié)（圖4A），礦化結(jié)節(jié)散在分布，周邊界限不清，周圍見PDLSCs，生長中心處結(jié)節(jié)較多。經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4周后，油紅O染色顯示細胞內(nèi)出現(xiàn)密集的脂滴（圖4B），PDLSCs向脂肪細胞分化。

2.4 PDLSCs的克隆形成能力和增殖率

克隆形成實驗結(jié)果顯示：傳代后的人PDLSCs能夠形成克隆細胞簇（圖5），鏡下觀呈克隆狀生長的PDLSCs呈長梭形，細胞體積較小，排列緊密；克隆中心部細胞界限不清，呈長梭形或形狀不規(guī)則；周邊部分細胞呈多角形或纖維狀。BrdU免疫細胞化學(xué)染色陽性率接近100%，說明PDLSCs對BrdU有較高的攝取率，即PDLSCs有較高的增殖能力（圖6）。

2.5 BMP-2對人PDLSCs的趨化效應(yīng)

在不同濃度下，PDLSCs對BMP-2顯示不同的趨化反應(yīng)。在100、200 ng·mL-1BMP-2實驗組，PDLSCs遷移至膜下表面的每高倍視野細胞數(shù)目分別是（71.33±4.01）、（45.83±3.30）個，細胞數(shù)目均明顯多于空白對照組的（35.75±2.63）個（P＜0.01）。100 ng·mL-1BMP-2實驗組對PDLSCs的趨化效應(yīng)強于200 ng·mL-1BMP-2實驗組（P＜0.01）。在消除細胞培養(yǎng)室上下腔中BMP-2濃度梯度后，遷移至膜下表面的每高倍視野細胞數(shù)目為（39.08±2.07）個，明顯少于僅下腔中含200 ng·mL-1BMP-2實驗組（P＜0.01），說明PDLSCs的遷移是由BMP-2引起的趨化效應(yīng)而不是PDLSCs的化學(xué)運動。

3 討論

再生性治療措施，如引導(dǎo)組織再生術(shù)[8]、局部應(yīng)用釉基質(zhì)蛋白[9]、各種生長因子的應(yīng)用[4]及干細胞移植[2]等方法，使牙周組織的再生取得了一定的進展。這些治療方法或通過促進牙周膜中未分化間充質(zhì)干細胞的不斷增殖提高功能細胞的數(shù)量，或誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為成牙骨質(zhì)細胞、成骨細胞來促進骨形成，或通過改善再生性細胞的功能促進細胞合成膠原、產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白、形成細胞外基質(zhì)并促進其礦化以修復(fù)牙周缺損。然而，從周圍組織或血管中募集更多再生性細胞至牙周缺損區(qū)可能是牙周組織再生過程中一個更重要的過程。

BMP-2因能夠促進未分化間充質(zhì)干細胞向成骨分化及其在牙骨質(zhì)和牙槽骨再生中的重要作用而成為牙周再生醫(yī)學(xué)中研究的熱點之一。已知BMP-2能夠改善PDLSCs的增殖狀態(tài)，促進其向成骨分化并刺激細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，誘導(dǎo)牙骨質(zhì)的形成及牙槽骨的改建來修復(fù)牙周缺損[5，10]。然而有關(guān)BMP-2對PDLSCs遷移效應(yīng)的研究較少。在骨創(chuàng)傷愈合和重建過程中，BMP-2作為一種重要的趨化因子，對間充質(zhì)祖細胞、骨祖細胞、成骨細胞具有募集效應(yīng)，并且對未分化成骨細胞的募集效應(yīng)強于分化成熟的成骨細胞[11-12]。在牙周炎治療過程中表達增高的BMP-2可能也參與對牙周膜中未分化間充質(zhì)干細胞的募集[13]。因此，設(shè)想BMP-2對牙周組織中再生性細胞的募集效應(yīng)可能是其促進牙周組織再生的另一個機制。Seo等[3]將牙周膜中未分化間充質(zhì)細胞成功分離出來，并將其命名為牙周膜干細胞。其具有多向分化能力和牙周再生的潛能，是牙周組織再生的主要功能細胞。

本實驗發(fā)現(xiàn)人PDLSCs對BMP-2具有明顯的趨化反應(yīng)，并證實PDLSCs的遷移運動是由BMP-2引起的趨化效應(yīng)而不僅是PDLSCs的化學(xué)運動。因此，在牙周組織工程中，外源性的BMP-2或者局部表達增高的BMP-2可能參與從鄰近組織或血管周圍向病損區(qū)域募集PDLSCs，這一效應(yīng)可能是其促進牙周組織再生的重要機制之一。這些細胞不僅能向成骨細胞分化促進骨形成和骨改建，而且可能也為牙周膜組織再生和牙骨質(zhì)形成提供了更多的功能細胞。

本研究豐富了BMP-2對PDLSCs生物學(xué)行為影響的內(nèi)容，為其促進牙周組織再生提供了新的理論依據(jù)。同時也提示，探索能夠募集PDLSCs的趨化劑可能為牙周組織再生工程提供新的思路。

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