張 啟，包 斌，2，倪 玲，陳麗娟，田曉清，葛 亮，吳文惠，2

(上海海洋大學(xué) 1.食品學(xué)院，2.海洋科學(xué)研究院，上海 201306)

從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)的小分子生物活性物質(zhì)有萜類、胺及酰胺類、吲哚生物堿類、乙酰配基類、鹵酚類、大環(huán)內(nèi)酯類、生物活性肽、環(huán)肽類及聚丙酸酯類，這些小分子物質(zhì)的生物活性作用主要體現(xiàn)在抗腫瘤、抗微生物、抗炎、抗凝血、降血壓、抗氧化、酶抑制活性等。目前從海洋稀有微生物長孢葡萄穗霉(Stachybotrys longispora)分離纖溶活性化合物的還鮮有報道，我們對本研究室在2008年報道的一株產(chǎn)纖溶活性化合物的菌株長孢葡萄穗霉FG216(Stachybotrys longispora 216)培養(yǎng)液中纖溶活性化合物FGFC1(fungi fibrinolytic compound 1)采用鹽效應(yīng)的分離效果進行了研究。

近年來，鹽效應(yīng)分離作為一種新型分離技術(shù)越來越受到人們的重視，自然界種類繁多的無機鹽都具有一定程度的鹽效應(yīng)［1-4］。在充分考慮無機鹽的離子價態(tài)、離子體積的基礎(chǔ)上，同時分析鹽效應(yīng)與系統(tǒng)組分、組成、鹽濃度等因素的關(guān)系一般能獲得理想的分離效果［5］。

FGFC1屬于吡喃并異吲哚酮類小分子化合物(結(jié)構(gòu)分析將另文報道)，在從培養(yǎng)液萃取的過程中，改善萃取環(huán)境會提高FGFC1的提取效率，如利用鹽效應(yīng)來提高萃取分離效果，加入溶于水相但本身不被萃取也不與溶質(zhì)發(fā)生化學(xué)作用的鹽如氯化鈉、氯化銨為鹽析劑，由于水合作用，鹽析劑吸引了一部分自由水分子，使水溶液中自由水分子的量減少，被萃取物在水中的濃度相應(yīng)增加，有利于FGFC1萃取。

基于上述的鹽效應(yīng)理論和FGFC1的特性，本文探討了氯化鈉、氯化銨和氯化鈣三種鹽對FGFC1提取效果的的影響并測定了FGFC1的化學(xué)特性。

1 材料

長孢葡萄穗霉FG216(Stachybotrys longispora 216)分離自舟山群島海域離岸100 m附近的上層海水，液體保藏于－80℃冰箱，該菌株為本實驗室所擁有。

長孢葡萄穗霉FG216培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖(Potato Sucrose Agar，PSA)斜面培養(yǎng)基［6］;種子培養(yǎng)基為不含有瓊脂的GSB培養(yǎng)基(葡萄糖35 g，可溶性淀粉10 g，脫脂大豆粉20 g，細菌學(xué)蛋白胨5 g，牛肉膏蛋白胨5 g，酵母提取物3 g，氯化鈉2 g，磷酸氫二鉀 0.5 g，硫酸鎂 0.05 g，水1000 mL，pH 為5.8)。發(fā)酵培養(yǎng)基為改良察氏培養(yǎng)基［7］(蔗糖50 g，硝酸鈉 3 g，磷酸氫二鉀 0.1 g，硫酸鎂 0.5 g，氯化鉀 0.5 g，酵母提取物 1 g，氯化鈷 0.002 5 g，硫酸亞鐵0.015 g，氯化鈣0.006 5 g，水1 000 mL，pH 為5.8)。

QHZ-98A全溫震蕩培養(yǎng)箱、LHS-250SC型恒溫恒濕培養(yǎng)箱、CR21G高速冷凍離心機，日本Hitachi;島津SCL－10Avp分析型高效液相色譜儀;島津LC-10AD)半制備型高效液相色譜儀;UV1102紫外可見分光光度計;基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀(Voyager-DE-PRO MALDI-TOF);尼高力激光顯微拉曼光譜儀(DXR)。

2 方法

2.1 菌株活化與種子培養(yǎng)液的制備

將冷凍保藏的長孢葡萄穗霉FG216于室溫下解凍，取50 μL接種于PSA斜面培養(yǎng)基于25℃培養(yǎng)一周。將PSA斜面長孢葡萄穗霉FG216菌株接種于裝有GSB種子培養(yǎng)基100 mL的500 mL錐形瓶中，25℃，180 r/min培養(yǎng)72 h即為種子培養(yǎng)液。

2.2 長孢葡萄穗霉FG216的發(fā)酵條件

取長孢葡萄穗霉FG216種子培養(yǎng)液以1%的接種量分別添加至5個含有發(fā)酵培養(yǎng)基200 mL的1 000 mL錐形瓶中，25℃，180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)120 h。

2.3 FGFC1的提取與純化

FG216發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，加入等體積的甲醇，超聲處理15 min，10 000 r/min離心15 min，棄沉淀，上清液在40～60℃除去甲醇并減壓濃縮至300 mL，調(diào)pH至3，分成3組，每組100 mL，分別加入不同的鹽使其飽和度分別為20%，40%，60%，80%和90%，之后用乙酸乙酯萃取3次，每次100 mL，收集乙酸乙酯層，加入無水硫酸鈉10 g，靜置12 h，經(jīng)過濾后減壓濃縮至干，真空干燥12 h，溶于適量甲醇后用于HPLC分析。

采用半制備型高效液相色譜儀。流動相為甲醇-0.05 mol/L乙酸銨溶液(70∶30)，流速為10 mL/min，進樣量為0.5 mL，檢測波長為265 nm，用 Sepax HP-C18色譜柱(21.2 mm ×250 mm，10 μm)精制。

2.4 標準曲線的繪制與FGFC1含量分析

色譜柱為 Waters HP-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.05 mol/L 乙酸銨(70∶30)，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長為265 nm。分別測定 FGFC1 的濃度為 40，60，80，100，200和500 μg/mL時的色譜峰面積。以FGFC1的濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸，標準曲線方程為:Y=107 81 X，r=0.997 9。

采用上述方法測定粗提物中FGFC1的HPLC峰面積，重復(fù)3次，取平均值。由FGFC1濃度與峰面積的線性關(guān)系即可求得粗提物中FGFC1的濃度。

2.5 質(zhì)譜分析

用0.1%三氟乙酸溶液-乙腈(50∶50)把 α-氰基-4-羥基-肉桂酸配制成5 g/L的基質(zhì)溶液。FGFC1用甲醇配制成濃度為1 mg/mL的溶液。取樣品溶液1 μL與飽和基質(zhì)上清液1 μL混勻后在離子源加速電壓分別為9和16 kV的條件下在500～1 000范圍內(nèi)掃描。

2.6 紫外光譜分析和拉曼光譜分析

將樣品用甲醇配成10 μg/mL的溶液，用1 cm比色皿于190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。

激光顯微拉曼光譜的激光波長為780 nm，波長掃描范圍為200～3 300 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 發(fā)酵液粗提物的HPLC圖譜和FGFC1的保留時間

長孢葡萄穗霉FG216發(fā)酵液處理后，粗提物以甲醇-0.05 mol/L乙酸銨溶液(70∶30)為流動相經(jīng)Waters HP-C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)分析的HPLC圖譜如圖1所示。圖1A顯示長孢葡萄穗霉FG216發(fā)酵液在無鹽效應(yīng)存在條件下乙酸乙酯萃取物主要成分有6種，其保留時間分別為8.172，9.525，11.519，13.528，16.860 和 22.138 min，其中保留時間為 16.860 min的物質(zhì)為 FGFC1［7］，F(xiàn)GFC1 的峰面積最大。

圖1 發(fā)酵液的無鹽效應(yīng)粗提物(A)和鹽效應(yīng)(氯化鈉)粗提物(B)的HPLC圖譜Fig.1 The chromatogram of HPLC from the crude extract of Stachybotrys longispora 216 culture by non-salt effect(A)and by salt effect(B)

3.2 鹽效應(yīng)對FGFC1提取效果的影響

長孢葡萄穗霉FG216發(fā)酵液處理后，分別在上清濃縮液中添加氯化鈉、氯化銨和氯化鈣至其飽和度為60%，經(jīng)乙酸乙酯萃取后得到的FGFC1粗提物的HPLC圖譜特性見表1。

表1 鹽效應(yīng)對FGFC1保留時間和提取率的影響Tab.1 Effects of retention time and extraction percentage of FGFC1 by salt effect

添加氯化鈉、氯化銨和氯化鈣在發(fā)酵液濃縮液中的濃度分別為 3.72，4.27 和 4.04 mol/L，即飽和度為60%的情況下，F(xiàn)GFC1保留時間與無鹽效應(yīng)的相比較，分別延長了0.12 s(圖1B)，7.86 s(圖未顯示)和38.70 s(圖未顯示)。由標準曲線計算可得乙酸乙酯粗提物中有氯化鈉、氯化銨和氯化鈣等鹽效應(yīng)存在的條件下，F(xiàn)GFC1的濃度分別為18.8，8.43和9.42 mg/mL，與無鹽效應(yīng)的乙酸乙酯粗提物中的FGFC1的濃度16 mg/mL相比較其提取率分別為118%，53%和59%。

該結(jié)果清楚表明，加入氯化鈉于發(fā)酵液濃縮液獲得的粗提物中FGFC1的濃度最高，氯化鈉鹽效應(yīng)具有優(yōu)良的提取效果。

3.3 不同濃度氯化鈉對FGFC1提取效果的影響

添加氯化鈉在發(fā)酵液濃縮液中的飽和度分別為20%，40%，60%，80%和90%的情況下，測定了不同氯化鈉濃度對FGFC1提取率的影響。

圖2 鹽飽和度對分離效果的影響Fig.2 The effect of salt saturation on the separation

圖3 鹽效應(yīng)分離FGFC1的HPLC圖譜Fig.3 The chromatogram of FGFC1 on salt effects

從圖2看到，隨著氯化鈉飽和度從20%升高到90%，氯化鈉鹽效分離作用顯著增強，飽和度達到60%以上時，氯化鈉鹽效分離作用趨于最大，達到18.8 mg/mL的提取濃度。同樣是1價陽離子的銨根離子的鹽溶液中，隨著飽和度從20%升到60%，鹽效分離作用增至最大，達到8.43 mg/mL的提取濃度，隨著飽和度的增大，鹽效分離作用降低。在2價陽離子鈣離子的鹽溶液中，隨著飽和度從20%升到90%，鹽效分離作用逐漸增大。

圖2的結(jié)果顯示，隨著氯化鈉、氯化銨和氯化鈣的鹽濃度從低到高，鹽效分離作用效果基本呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢，但過高的氯化銨濃度減弱了分離FGFC1的鹽效應(yīng)。

3.4 鹽效應(yīng)對FGFC1的純化作用

對通過氯化鈉鹽效應(yīng)所得的粗提物用半制備型HPLC進行分離。FGFC1在半制備型HPLC的保留時間為51.738 min。收集的FGFC1溶出液純度分析色譜圖見圖3?？梢钥闯?，F(xiàn)GFC1的單一峰顯示在HPLC圖譜上，沒有其他雜質(zhì)峰的出現(xiàn)，F(xiàn)GFC1通過鹽效應(yīng)被精制。

3.5 鹽效應(yīng)對FGFC1質(zhì)譜和光譜特性的影響

精制的FGFC1經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后用于化學(xué)特性的分析。FGFC1為黃色粉末，易溶于甲醇、氯仿、二甲亞砜等溶劑。其基質(zhì)輔助激光解離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry)如圖4所示。FGFC1主要離子碎片的質(zhì)荷比(m/z)分別為 861(M+H)+，771，817，843，877，921。

圖4 FGFC1的飛行時間質(zhì)譜Fig.4 Time-of-flight mass spectrometry of FGFC1

圖5 FGFC1的紫外吸收光譜Fig.5 The ultraviolet absorption spectrum of FGFC1

FGFC1紫外吸收光譜如圖5所示，可見，在190～400 nm波長范圍內(nèi)，F(xiàn)GFC1在221，268和310 nm波長處有最大吸收，其摩爾吸光系數(shù)ε分別為4.01×104，1.53 ×104和 5.59 ×103。FGFC1 在 250 ～350 nm波長內(nèi)顯示中、低強度的吸收，說明羰基或共軛羰基的存在。

FGFC1的拉曼光譜表明 FGFC1在 3 297，2916，1624，1435，1379，1011cm－1處有吸收峰。3 297 cm－1為不飽和碳氫基團(=C－H)引起的伸縮振動(=C－H);2 916 cm－1為飽和碳氫基團(CH)引起的伸縮振動(C－H);1 624 cm－1為C=C引起的伸縮振動(C=C)，表明有C=C;1 435 cm－1為飽和碳氫基團(C－H)引起的彎曲振動(δC－H)，表明有－CH2或 －CH3，同時在1 379cm－1處有吸收峰，說明有－CH3;1 011 cm－1為C－O鍵引起的伸縮振動(C=O)，證明有-OH。

4 結(jié)論

本文基于鹽效應(yīng)理論，通過加入氯化鈉、氯化銨或氯化鈣三種鹽改善FGFC1的萃取環(huán)境發(fā)現(xiàn)FGFC1在加入氯化鈉的提取液濃度最大，提取率最高。與常用的甲醇提取法［1］相比，采用介于氯化鈉鹽效應(yīng)的FGFC1分離方法能顯著提高分離效果。

從鹽效分離理論分析，鹽在溶劑中的溶解度大小表征了溶劑分子能結(jié)合鹽的數(shù)量，當鹽在二溶劑中溶解度差越大時，鹽效應(yīng)也越大。氯化鈉在水中和乙酸乙酯中的溶解度分別是0.110 0和0.000 5 mol/mol，氯化鈣在水中和乙酸乙酯中的溶解度分別是 0.120 0 和0.106 8 mol/mol，在兩種溶劑中氯化鈉溶解度之差為0.109 5 mol，遠大于氯化鈣的0.003 2 mol，本文所得到結(jié)果和該理論相一致。

通過質(zhì)譜、紫外光譜以及拉曼光譜分析了通過氯化鈉鹽效應(yīng)分離得到的FGFC1的質(zhì)譜和光譜特性，與采用無鹽效分離方法的FGFC1的特性相比，兩者的特性一致，采用氯化鈉鹽效分離FGFC1能達到分離目的。

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