張麗莉 李世俊 司玉玲 梁芳芳 龐 華王玫

白血病是來源于血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，是一組造血細(xì)胞大量分化受阻的惡性、克隆性、增生性疾病。60%~80%的患者經(jīng)聯(lián)合治療后病情可緩解，但大多數(shù)患者終因復(fù)發(fā)而死亡。目前研究認(rèn)為白血病干細(xì)胞（LSC）是白血病耐藥復(fù)發(fā)的根源[1]，也是治療的難點(diǎn)。針對(duì)LSC免疫治療的研究較多，過繼免疫治療是免疫治療的一個(gè)重要手段，該法通過直接向腫瘤患者體內(nèi)輸注具有抗腫瘤活性的免疫活性細(xì)胞，使其在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）和樹突細(xì)胞（DC）聯(lián)合的免疫治療越來越受到臨床關(guān)注，DC-CIK共同培養(yǎng)可明顯提高CIK的增殖活性和細(xì)胞毒作用[2]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察DC-CIK共培養(yǎng)對(duì)自身LSC的殺傷作用，以探索白血病免疫治療的新方法。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所2010年9月—2011年9月收治的慢性粒細(xì)胞白血病加速期（CML-AP）患者10例，其中男6例，女4例，年齡35~78歲，中位年齡51歲，慢性期病程0.5~7.5年。所有患者診斷均符合參考文獻(xiàn)[3]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)或細(xì)胞分子學(xué)檢測(cè)確診，熒光原位雜交（FISH）技術(shù)檢測(cè)BCR/ABL融合基因陽(yáng)性。

1.2 主要試劑與儀器 （1）試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司），新生胎牛血清、淋巴細(xì)胞分離液（天津血液研究所試劑公司），別藻青蛋白（APC）-CD34、藻紅蛋白（PE）-CD38、異硫氰酸熒光素（FITC）-CD44、FITC-CD40、APC-HLA-DR、PE-CD80、葉 綠 素 蛋 白（Per?cp）-cy5.5-CD56、PE-cy7-CD83、PE-CD8、FITC-CD3、FITCP-GP（美國(guó)BD Bioscience公司），LDH釋放實(shí)驗(yàn)試劑盒（美國(guó)Promega公司），重組人血小板生成素（rhTPO）、重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhSCF）、重組人FMS樣酪氨酸激酶3（FLT3）配體、重組人白細(xì)胞介素（rhIL）-3、重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、rhIL-4、重組人腫瘤壞死因子（rhTNF）-α、rhIL-2、重組人干擾素（rhIFN）-γ（英國(guó)Peprotech公司），抗人CD3單抗（武漢生物制品研究所）。BCR/ABL融合基因檢測(cè)試劑盒（北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司）。（2）儀器：倒置顯微鏡（日本Olympus公司），超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司），流式分選儀、流式分析儀（美國(guó)BD公司），CO2孵箱（Ther?mo Forma公司）。

1.3 方法

1.3.1 LSC分離 無菌采集CML-AP患者骨髓3~5 mL，肝素抗凝，以淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法獲得1×108個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMMC），使用常規(guī) APC-CD34、PE-CD38、FITC-CD44抗體標(biāo)記。用BD公司流式分選儀將標(biāo)記好的BMMC以少量的標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行分選預(yù)實(shí)驗(yàn)，顯示良好的分選效果后，進(jìn)行大批量的分選。收集CD34+CD38-CD44+細(xì)胞。滴片觀察細(xì)胞形態(tài)，并用苔盼蘭檢測(cè)細(xì)胞活率。

1.3.2 LSC擴(kuò)增及DC的誘導(dǎo) 收集LSC，調(diào)整細(xì)胞濃度為（4~5）×104/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，1 mL/孔。用完全培養(yǎng)基（含10%FCS的1640培養(yǎng)液），37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。用SFT因子組合（最終質(zhì)量濃度rhSCF 100 μg/L、rh?FLT3 100 μg/L、rhTPO 100 μg/L、rhIL-3 10 μg/L）擴(kuò)增2周，擴(kuò)增至第6~7天第1次換液，補(bǔ)充等量完全培養(yǎng)基及全量細(xì)胞因子rhSCF、rhFLT3、rhTPO，3~4 d后第2次換液，調(diào)整細(xì)胞濃度為（4~5）×105/mL，補(bǔ)充全量上述細(xì)胞因子。擴(kuò)增2周后誘導(dǎo) DC，加入終濃度為 100 μg/L 的 rhGM-CSF、20 μg/L 的rhIL-4，在37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3~4 d換液1次調(diào)整細(xì)胞濃度（4~5）×105/mL，并補(bǔ)入全量的上述細(xì)胞因子，培養(yǎng)至6~8 d加入TNF-α 20 μg/L，3~4 d后收獲。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，每日觀察細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC免疫表型。

1.3.3 CIK的培養(yǎng)及檢測(cè) 取經(jīng)CML-AP治療后達(dá)到完全血液學(xué)緩解的患者骨髓，分離BMMC，在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h，收集非黏附細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3×106/mL，接種于24孔培養(yǎng)板中，1 mL/孔。當(dāng)天即加入 50 μg/L 的 rhIFN-γ，刺激 24 h后，加入抗人CD3單抗50 μg/L及rhIL-2 30 μg/L，以后每3 d用含有30 μg/L rhIL-2的新鮮CIK培養(yǎng)液全量換液。培養(yǎng)到第7天，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型，并將CIK與DC按10∶1比例混合培養(yǎng)。到共培養(yǎng)第7天收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL作為效應(yīng)細(xì)胞。

1.3.4 細(xì)胞免疫表型及P-糖蛋白（P-gp）的檢測(cè) 收集培養(yǎng)后的DC及共培養(yǎng)后的細(xì)胞，加入FITC-CD40、APC-HLA-DR、PE-CD80、PE-cy7-CD83；培養(yǎng)后CIK及共培養(yǎng)后的細(xì)胞加入Percp-cy5.5-CD56、PE-CD8、FITC-CD3；培養(yǎng)后的 DC 加入FITC-P-GP，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型及P-gp表達(dá)。

1.3.5 FISH法檢測(cè)BCR/ABL融合基因 取分選后的白血病干細(xì)胞和培養(yǎng)后的DC，用新鮮配制的固定液（甲醛∶冰乙酸=3∶1）洗2遍后固定。20~30 cm高度滴于制備好的載玻片上，于2×SSC中浸泡15 min老化后，依次于75%、85%、100%乙醇中脫水1 min。自然干燥后在顯微鏡下畫好細(xì)胞區(qū)域。在室溫黑暗中，按照7∶2∶1比例將緩沖液、去離子水、探針加于EP管中配制探針混合物。按照10 μL/玻片，將探針混合物加于載玻片上已畫好的細(xì)胞區(qū)域中，然后蓋上蓋玻片，用封片膠封片，置于濕盒中，42℃過夜。移去蓋玻片，載玻片放入78℃，2×SSC/0.3NP-40洗液中，洗2 min，然后于室溫2×SSC/0.1NP-40洗液中，洗1 min，烤箱干燥。DAPI復(fù)染劑10 μL加于雜交區(qū)域。干燥后，用Olympus顯微鏡選用合適的濾光片觀察并分析。正常間期細(xì)胞信號(hào)特征為2個(gè)綠色和2個(gè)紅色熒光信號(hào)；BCR/ABL融合基因如果為主要斷裂點(diǎn)融合方式，單個(gè)間期細(xì)胞胞核中則顯示1紅1綠1黃1小紅熒光信號(hào)，如果為次要斷裂點(diǎn)融合方式，單個(gè)間期細(xì)胞核中則顯示1紅1綠2黃熒光信號(hào)。

1.3.6 乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用 將DC與CIK共同培養(yǎng)后的細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。同一患者BMMC分選后的CD34+CD38-CD44+細(xì)胞作為靶細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/mL。LDH釋放法分別測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組在效靶比10∶1、20∶1、40∶1時(shí)的殺傷活性。每一效靶比下，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度（OD）值。按以下公式計(jì)算：

殺傷率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放OD值-靶細(xì)胞自然釋放OD值）（/靶細(xì)胞最大釋放OD值-靶細(xì)胞自然釋放OD值）×100%

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni-t法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC增殖情況及P-gp表達(dá) 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)一致，圓形，胞體較小。苔盼蘭染色顯示：細(xì)胞活率>95%。培養(yǎng)第5~7天，出現(xiàn)細(xì)胞體積增大，數(shù)量增多，2~8個(gè)細(xì)胞形成小細(xì)胞團(tuán)，多形性細(xì)胞增多。誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d左右，細(xì)胞聚集成團(tuán)，胞體較大，易見細(xì)長(zhǎng)的樹枝狀突起，細(xì)胞數(shù)量增加20~40倍。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，DC所占比例逐漸增大，培養(yǎng)前不足1%，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)具有典型DC形態(tài)的細(xì)胞已達(dá)60%~80%，見圖1。取培養(yǎng)后的DC檢測(cè)P-gp表達(dá)，陽(yáng)性率為（60.61±12.38）%。

Figure 1 DC with tipical morphology（A：×100，B：×400）圖1 顯微鏡下具有典型形態(tài)的樹突細(xì)胞（A：×100，B：×400）

2.2 培養(yǎng)前后DC免疫表型分析 CIK與DC共培養(yǎng)后，CD40、CD80、CD83及HLA-DR的構(gòu)成均高于共培養(yǎng)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

Table 1 The analysis of DC’s immunophenotypes after co-cultured with CIK表1 DC共培養(yǎng)前后免疫表型分析（n=10，%±s）

Table 1 The analysis of DC’s immunophenotypes after co-cultured with CIK表1 DC共培養(yǎng)前后免疫表型分析（n=10，%±s）

**P<0.01

時(shí)間DC共培養(yǎng)前DC共培養(yǎng)后t CD40 41.28±10.76 77.79±11.98 7.171**CD80 46.35±13.10 81.50±9.45 6.877**CD83 32.41±4.30 82.76±6.20 10.185**HLA-DR 50.28±9.93 70.48±11.01 8.775**

2.3 BCR/ABL融合基因檢測(cè) 取4例CML患者分選后白血病干細(xì)胞檢測(cè)BCR/ABL融合基因重排，LSC的BCR/ABL融合基因表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為（80.84±17.18）%，見圖2A；誘導(dǎo)結(jié)束后DC的BCR/ABL融合基因表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為（48.42±20.69）%，見圖2B；差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.411，P>0.05）。

2.4 共培養(yǎng)前后CIK免疫表型分析 CIK與DC共培養(yǎng)后，CD3、CD3CD8、CD3CD56的成熟表型表達(dá)率高于共培養(yǎng)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.5 不同效靶比時(shí)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用 3種效靶比對(duì)應(yīng)的殺傷率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），隨著效靶比的增加，細(xì)胞殺傷作用增強(qiáng)，各效靶比間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表3。

Figure 2 The expression of bcr/abl fusion gene圖2 BCR/ABL融合基因表達(dá)圖

Table 2 The analysis of CIK's immunophenotypes after co-cultured with DC表2 CIK共培養(yǎng)前后免疫表型分析（n=10，%，x ±s）

Table 3 The comparison of killing effects in different effector-target ratio表3 不同效靶比時(shí)殺傷率比較 （n=10，%±s）

Table 3 The comparison of killing effects in different effector-target ratio表3 不同效靶比時(shí)殺傷率比較 （n=10，%±s）

**P<0.01

10∶1（1）20∶1（2）40∶1（3）F 11.15±3.94 31.13±12.01 59.13±12.82 53.77**組比（1）∶（2）（2）∶（3）（1）∶（3）t 4.30**6.02**10.32**統(tǒng)計(jì)學(xué)處理效靶比 殺傷率

3 討論

LSC位于細(xì)胞克隆的起始階段，對(duì)白血病的發(fā)生、發(fā)展起著關(guān)鍵性作用，是白血病耐藥復(fù)發(fā)的根源。以ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為治療靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)，針對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的治療主要集中在抑制其功能方面，并取得可喜的進(jìn)展，但在臨床研究過程中，因其巨大不良反應(yīng)、非特異性殺傷正常生理ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及定位腫瘤細(xì)胞表面功能差等多種原因限制了此項(xiàng)研究的發(fā)展，而siRNA、基因治療及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗體的臨床研究面臨同樣困難，故以ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為靶點(diǎn)的生物免疫治療被大多數(shù)研究者看好。近年來聯(lián)合DC和CIK免疫治療LSC的研究逐漸受到關(guān)注，其能較徹底的清除殘余腫瘤細(xì)胞，被認(rèn)為是具有較大潛力的治療措施。

CIK 是在白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-1、干擾素（IFN）-γ和Anti-CD3單抗等作用下，由外周血、骨髓或臍血中分離出的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)而獲得的一種具有細(xì)胞毒作用的免疫活性細(xì)胞。目前公認(rèn)的其抗腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制是非主要組織相容性復(fù)合體（MHC）限制性殺傷腫瘤細(xì)胞，它在體內(nèi)體外均具有較高抗腫瘤活性，可以通過分泌細(xì)胞質(zhì)顆粒，分泌穿孔蛋白（PFP），產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-2等），通過配體受體（Fas∶Fc）介導(dǎo)等多種殺瘤機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞。Linn等[4]研究表明，白血病患者的自體CIK細(xì)胞具有殺傷自體及異體白血病細(xì)胞的作用。DC是已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，是激發(fā)特異性免疫應(yīng)答的中心和抗腫瘤免疫的重要載體，其不僅可以提呈抗原激發(fā)T細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答，還可以促進(jìn)非特異性的細(xì)胞毒殺傷，以DC為基礎(chǔ)的免疫治療已經(jīng)成為癌癥治療最有希望的辦法之一。楊棟林等[5]成功地從CML患者骨髓CD34+細(xì)胞中擴(kuò)增誘導(dǎo)出大量DC。Eisendle等[6]研究發(fā)現(xiàn)CML造血干細(xì)胞在一定細(xì)胞因子作用下能夠沿著DC的發(fā)育途徑正常分化為DC。有報(bào)道證實(shí)造血干細(xì)胞能成功誘導(dǎo)為DC，不受白血病患者的疾病分期、治療情況等的影響，其產(chǎn)率和正常人相同[7]。

P-gp是由mdr1基因編碼的一種糖蛋白，在血液腫瘤中，mdr1 mRNA以及其產(chǎn)物P-gp的高度表達(dá)已被證實(shí)為最重要的多藥耐藥機(jī)制。Jonker等[8]研究認(rèn)為P-gp的高表達(dá)是腫瘤干細(xì)胞的重要特征。慢性粒細(xì)胞白血病特征性的細(xì)胞遺傳學(xué)變化是pH染色體陽(yáng)性，BCR/ABL融合基因是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)，因此本研究選擇P-gp及BCR/ABL融合基因作為CML白血病干細(xì)胞的標(biāo)志進(jìn)行分析，結(jié)果顯示DC高表達(dá)P-gp，BCR/ABL融合基因陽(yáng)性，DC具有典型的干細(xì)胞標(biāo)志，且CML特征性的遺傳學(xué)標(biāo)志表達(dá)陽(yáng)性，因此其具備CML白血病干細(xì)胞的特征。

本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，與DC共培養(yǎng)后，CIK細(xì)胞數(shù)目增多，增殖速率加快，成熟表型表達(dá)率增高，殺傷腫瘤能力增強(qiáng)[9]。本實(shí)驗(yàn)將CML干細(xì)胞DC與CIK共同培養(yǎng)，用流式細(xì)胞方法檢測(cè)共培養(yǎng)前后的DC和CIK細(xì)胞免疫表型，發(fā)現(xiàn)DC與CIK共同培養(yǎng)后，表達(dá)成熟免疫表型，且表達(dá)率比共培養(yǎng)前增高，提示DC、CIK培養(yǎng)成熟，且共同培養(yǎng)可提高DC、CIK成熟度，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[9]。通過檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷效應(yīng)，結(jié)果顯示效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞有殺傷作用，且隨著效靶比的增加殺傷活性增強(qiáng)，提示LSC來源的DC與CIK共培養(yǎng)對(duì)自身LSC有殺傷作用。其機(jī)制可能為：（1）DC高表達(dá)MHC-Ⅱ類分子（HLA-DR）和CD80/CD86等共刺激分子，為CIR活化提供信號(hào)刺激，激活的CIK通過免疫球蛋白Fc受體使淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的親和力增高，并向細(xì)胞間排出含有BLT的胞漿毒性顆粒，引發(fā)胞漿毒性顆粒依賴性溶細(xì)胞作用。（2）DC分泌高水平IL-2、IL-12、IFN-γ等多種細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)CIR生成，促進(jìn)CIK的活化和增殖，間接啟動(dòng)CIK[10]，并提高CIK分泌白細(xì)胞介素-4（IL-4）、干擾素γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子的能力，增強(qiáng)體內(nèi)外抗腫瘤活性[11]。但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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