張 靜， 張 聰*， 胡 馨， 蔡國(guó)琴， 張英華， 鄧捷圓

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203;2.上海市中藥研究所，上海201204)

野山參Panax ginseng C.A.Mey.為五加科人參屬植物，具有大補(bǔ)元?dú)?、益肺、生津、安神等功效?］。野山參是我國(guó)的傳統(tǒng)名貴藥材，其藥用歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)?，F(xiàn)代藥物學(xué)研究已證明人參皂苷(ginsenosides)是其主要活性成分，因此含人參皂苷量的多少是評(píng)價(jià)人參內(nèi)在質(zhì)量的重要指標(biāo)［2］。本研究采用高效液相色譜法對(duì)野山參中的7種主要人參皂苷成分進(jìn)行了測(cè)定，有利于更全面、有效地控制野山參藥材的質(zhì)量。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 1200系列高效液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫公司)，包括 G1322A真空脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱和G1314B DAD檢測(cè)器;超聲波清洗器 (JIE 360型，上海杰理科技有限公司)。

1.2 藥品和試劑 人參皂苷對(duì)照品Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。野山參樣品由上海雷允上神象分公司提供，由副主任中藥師李躍雄、吳詠梅鑒定，為五加科Araliaceae植物Panax ginseng C.A.Meyer的干燥根莖，并為野生者。乙腈和甲醇為色譜純 (Fisher，USA)，正丁醇為分析純，水為Millipore純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷對(duì)照品 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd，分別為 1.22、1.62、0.43、 2.50、0.93、 1.01、 0.52 mg/mL， 置5mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為 0.244、0.324、0.086、0.500、0.186、0.202、0.104 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，置于4℃冰箱保存。

2.1.2 野山參藥材樣品溶液的制備 精密稱取野山參藥材粉末 (過三號(hào)篩)約1.0 g，置索氏提取器中，加70 mL三氯甲烷水浴回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙移入100 mL錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇60 mL，密塞，放置過夜，超聲處理15 min，濾過，棄去初濾液，精密量取濾液30 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

2.2.1 色譜條件Ⅰ 用于測(cè)定人參皂苷Rg1、Re。流動(dòng)相為乙腈-水 (21∶79)，等度洗脫;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm;體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 色譜條件Ⅰ下對(duì)照品 (A)與樣品 (B)圖譜Fig.1 References(A)and sample(B)spectrum of test methodⅠ

2.2.2 色譜條件Ⅱ 用于測(cè)定人參皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水梯度洗脫，0～25 min(28%A)，25～35 min(28% ～30%A)，35～45 min(30% ～32%A)，45～60 min(45% ～60%A);Eclipse Plus C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm;體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，見圖2。

3 方法學(xué)考察

圖2 色譜條件Ⅱ下對(duì)照品 (A)與樣品 (B)圖譜Fig.2 References(A)and sample(B)spectrum of test methodⅡ

3.1 線性關(guān)系考察 分別取混合對(duì)照品溶液1、2、4、8、12 μL進(jìn)樣，按色譜條件Ⅰ測(cè)定;分別取混合對(duì)照品溶液1、2、4、8、12 μL進(jìn)樣，按色譜條件Ⅱ測(cè)定，以進(jìn)樣量 (μL)為橫坐標(biāo)，含藥量 (μg)為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。結(jié)果 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd的回歸方程分別為 :Y=273.79X－6.8464，r=0.9999;Y=241.81X+33.911，r=0.9999;Y=287.97X+0.1368，r=0.9999;Y=204X+6.0269，r=0.9999;Y=202.65X－1.1632，r=0.9999;Y=194.52X－1.5755，r=0.9999;Y=246.03X+0.5252，r=0.9999。線性范圍分別為1.50～18.02 μg，2.02～ 24.24 μg，0.25 ～ 3.05 μg，1.34 ～ 16.08 μg，0.70 ～8.42 μg，0.71 ～8.50 μg，0.30 ～3.57 μg。

3.2 精密度試驗(yàn) 取8號(hào)樣品溶液，按色譜條件Ⅰ測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次測(cè)定，結(jié)果人參皂苷Rg1、Re色譜峰面積的RSD值均小于2%;按色譜條件Ⅱ測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次測(cè)定，結(jié)果人參皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd色譜峰面積的RSD值均小于3%。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取8號(hào)樣品，平行制備5份樣品溶液，按色譜條件Ⅰ測(cè)定，結(jié)果人參皂苷Rg1、Re的RSD值均小于3%;按色譜條件Ⅱ測(cè)定人參皂苷 Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的 RSD 值均小于3%。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取8號(hào)樣品同一溶液，按色譜條件Ⅰ和Ⅱ分別于0、2、4、8、10、12 h測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd色譜峰面積的RSD均小于3%。

3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的同一批次野山參樣品1 g共9份，每3份為1組，分別按樣品中各人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd含有量的80%、100%、120%精密加入對(duì)照品溶液，按2.1.2項(xiàng)下制備，分別按色譜條件Ⅰ和Ⅱ進(jìn)樣分析，記錄色譜峰，各人參皂苷回收率的結(jié)果為97.06%、98.37%、98.71%、98.88%、100.43%、98.80%，RSD分別為 0.51%、1.88%、2.13%、0.98%、1.43%、0.61%、1.73%。

4 樣品測(cè)定

按2.1.2項(xiàng)下方法制備18批野山參藥材樣品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見表1。

表1 18批野山參樣品中7種人參皂苷的測(cè)定結(jié)果 (n=2)Tab.1 Determination results of ginsenosides in wild ginseng(n=2)

5 討論

5.1 超聲提取部分的正交試驗(yàn) 對(duì)于超聲提取，本實(shí)驗(yàn)選擇L9(34)表，考察了3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平;溶劑種類考察了甲醇、70%乙醇、水飽和正丁醇;溶劑體積考察了50、60、70 mL;超聲時(shí)間考察了15、30、45 min。結(jié)果表明水飽和正丁醇的提取效率最高，體積以60 mL最佳，而超聲時(shí)間的影響不大，所以采用以1 g樣品中加入水飽和正丁醇60 mL提取15 min作為最佳前處理?xiàng)l件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal experiment

5.2 提取方法的選擇 參考2010年版《中國(guó)藥典》，考察了正丁醇超聲之前采用三氯甲烷回流除雜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除雜后得到的總皂苷含有量18.26 mg/g，低于直接用正丁醇超聲得到的18.33 mg/g，但考慮到脂溶性成分對(duì)人參皂苷分離的影響，最終選擇了三氯甲烷回流法［3-4］。另外還考察了C18小柱對(duì)提取的影響，發(fā)現(xiàn)效果不明顯，所以未采用C18小柱對(duì)樣品進(jìn)行除雜。

5.3 液相條件的選擇

5.3.1 色譜柱的選擇 考察了Eclispe Plus C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)、Eclispe XDB C18柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)和 Zorbax C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)3種不同規(guī)格的柱子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然短柱可以縮短分析時(shí)間，但不能獲得良好的分離度，所以選擇 Eclispe Plus C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)。

5.3.2 流動(dòng)相的選擇 比較了甲醇-水、乙腈-水和90%乙腈-水系統(tǒng)，乙腈-水的分離效果最好［5-7］。由于人參皂苷類成分的最佳紫外吸收波長(zhǎng)為203 nm，接近末端吸收，在流動(dòng)相中加入甲酸或乙酸等含羰基的有機(jī)酸會(huì)明顯造成基線波動(dòng)，而加入磷酸對(duì)整體分離情況沒有明顯影響，最終選擇乙腈和純水作為最佳流動(dòng)相［8］。

5.3.3 流動(dòng)相比例的選擇 選擇合適的流動(dòng)相比例是分離的關(guān)鍵，由于很難使多種人參皂苷在同一流動(dòng)相系統(tǒng)中達(dá)到良好的分離［9］，同時(shí)，Rg1、Re極性非常相似，曾有多篇單獨(dú)分離這兩種成分的報(bào)道［10-12］，因此本實(shí)驗(yàn)單獨(dú)將這2種人參皂苷采用一種流動(dòng)相比例，其他5種人參皂苷采用梯度洗脫方法，使其均達(dá)到良好的分離度。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)18個(gè)批次的野山參藥材中7種皂苷成分進(jìn)行了測(cè)定，方法學(xué)考察表明，重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度和加樣回收率的范圍均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，在本研究介紹的供試品制備方法和色譜條件下，人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd分離良好，所建立的方法穩(wěn)定可靠，可以用來對(duì)野山參進(jìn)行質(zhì)量控制。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:8.

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