宇光海，尹艷麗，張 垚

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院生物工程系,河南 鄭州 450001)

達(dá)托霉素(DAP)屬于A21978C家族，是一種含有13個氨基酸的大環(huán)脂肽類抗生素，在玫瑰孢鏈霉菌中以非核糖體蛋白合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)機制合成，具有依賴于Ca2+破壞病菌細(xì)胞膜的新型作用，因此對許多耐藥病菌具有顯著的治療作用[1～4]。達(dá)托霉素具有在體外抗絕大多數(shù)臨床革蘭氏陽性菌的作用，對于一些可選擇的抗生素很少的耐藥菌，如耐萬古霉素的腸球菌(VRE)、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)、糖肽類敏感的金黃色葡萄球菌(GISA)、凝固酶陰性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRSP)等的感染具有有效的殺菌和抑菌效果[5]。達(dá)托霉素2003年被FDA批準(zhǔn)用來治療由革蘭氏陽性菌引起的皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染,2006年被FDA批準(zhǔn)用來治療由革蘭氏陽性菌引起的菌血癥和由耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的右側(cè)心內(nèi)膜炎[5]。因此，達(dá)托霉素已成為21世紀(jì)最具潛力和應(yīng)用價值的抗生素之一，其醫(yī)學(xué)價值、社會影響力與日俱增，市場前景廣闊。但仍存在產(chǎn)量低、成本高的問題。因此，提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量迫在眉睫。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成對于目的產(chǎn)物的形成有著顯著的影響。對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，可以顯著提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量[6，7]。近年來培養(yǎng)基優(yōu)化方法已經(jīng)由傳統(tǒng)的耗時耗力的非統(tǒng)計優(yōu)化方法逐漸發(fā)展為統(tǒng)計優(yōu)化方法，其中最為常用的是Plackett-Burman 設(shè)計、最陡爬坡設(shè)計與響應(yīng)面設(shè)計相結(jié)合的優(yōu)化方法。Plackett-Burman 設(shè)計從多種因素中篩選出主要影響因子[8]，最陡爬坡設(shè)計使主要因子的水平接近響應(yīng)面最大值，響應(yīng)面設(shè)計最后確定因素的最優(yōu)值[9]。該優(yōu)化方法已廣泛應(yīng)用于工程設(shè)計、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域，并取得了良好的效果[10]。

作者在此采用Plackett-Burman 設(shè)計、最陡爬坡設(shè)計與響應(yīng)面設(shè)計相結(jié)合的優(yōu)化方法對達(dá)托霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

達(dá)托霉素標(biāo)準(zhǔn)品，大連美倫生物技術(shù)有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；其它試劑均為分析純。

1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus)GC-68是StreptomycesroseosporusNRRL11379的自然篩選突變株，自行保藏。

高氏一號培養(yǎng)基(斜面固體培養(yǎng)基，g·L-1)：可溶性淀粉 20，KNO31，MgSO40.5，K2HPO40.5，NaCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，瓊脂粉 20，加蒸餾水定容至100 mL，pH值7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基(g·L-1):可溶性淀粉 20，KNO31，MgSO40.5，K2HPO40.5，NaCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，加蒸餾水定容至100 mL，pH值7.2～7.4。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖 7.5，糊精 10，可溶性淀粉 10，蛋白胨 8.5，酵母浸粉 6，干酪素 8.5，L-天冬氨酸 1，谷氨酸 0.5，MgSO40.5，K2SO40.5，K2HPO40.5，pH值7.2～7.4。

1.3 方法

將分離后的菌株接種于高氏一號培養(yǎng)基中，于30 ℃、濕度40%的條件下培養(yǎng)7 d；將斜面種子接種于已滅菌的種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)48 h左右；取1 mL種子培養(yǎng)液接種于設(shè)計的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、220 r·min-1搖床發(fā)酵7 d(48 h時加入0.2 g·L-1正癸酸)，測定菌體生長量和達(dá)托霉素產(chǎn)量，以確定最優(yōu)的培養(yǎng)基組成。

1.4 分析與檢測

菌體生長量的測定采用干重法[11]。

達(dá)托霉素產(chǎn)量的測定采用HPLC法[11]：分析柱為反相ODS柱，流動相為含0.1%三氟乙酸的乙腈-水(45.5∶54.5，體積比)，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，柱壓8～9 MPa，檢測波長220 nm。

實驗數(shù)據(jù)分析采用Design expert 7.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman設(shè)計

根據(jù)單因子實驗結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，并結(jié)合玫瑰孢鏈霉菌菌體生長和發(fā)酵的特點，選取11個因素(包括不同的碳源、氮源和微量元素)，根據(jù)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基成分分別選擇一個高水平、一個低水平，進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計實驗，考察培養(yǎng)基中的11個因素對達(dá)托霉素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計實驗結(jié)果/g·L-1

對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

由表2可知，除變量C、D、G的Prob>F值小于0.05外，其它變量的Prob>F值均大于0.05。說明在Plackett-Burman設(shè)計中，變量C、D、G顯著，而其它變量不顯著[12]。表明變量C、D、G的模型貢獻(xiàn)率較大，是構(gòu)建模型的主要影響因素。運用Design expert 7.0軟件對Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到關(guān)于響應(yīng)面的多元一次方程：DAP=233.17778+0.53333A-1.39167B-9.56000C-5.35333D-2.30000E+7.35556F-28.00000G，作為主要影響因素的變量C、D、G在多元一次方程中的系數(shù)都為負(fù)值，表明它們在模型中的影響均為負(fù)效應(yīng)，在后續(xù)的最陡爬坡設(shè)計中均需降低這些因素的實際濃度水平。

2.2 最陡爬坡設(shè)計

在Plackett-Burman設(shè)計得到的多元一次方程的基礎(chǔ)上，根據(jù)其系數(shù)的正負(fù)及大小，設(shè)計主要因素C、D、G的最陡爬坡實驗，選擇合適的上升路徑和步長，得出峰值，從而逼近其最大響應(yīng)區(qū)域，為下一步的響應(yīng)面設(shè)計做準(zhǔn)備[12]。其它次要因素均依照其在方程中系數(shù)的正負(fù)分別取Plackett-Burman設(shè)計編碼值的高水平或低水平。最陡爬坡設(shè)計實驗結(jié)果見表3。

由表3可知，3#實驗的達(dá)托霉素產(chǎn)量最高，達(dá)176.85 mg·L-1。故以3#實驗培養(yǎng)基配方作為響應(yīng)面設(shè)計中心點。

表2 Plackett-Burman設(shè)計實驗方差分析

表3 最陡爬坡設(shè)計實驗結(jié)果

2.3 響應(yīng)面設(shè)計

以最陡爬坡設(shè)計得到的培養(yǎng)基配方為中心點，運用Design expert 7.0軟件的Box-Behnken設(shè)計，針對主要因素C、D、G的濃度使用中值組合重新編碼，以達(dá)托霉素的產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計實驗[13]，其因素與水平見表4。

表4 Box-Behnken設(shè)計實驗的因素與水平

糊精、可溶性淀粉和L-天冬氨酸的濃度水平如表4所示，其它次要因素均取最低水平，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計實驗，結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken設(shè)計實驗結(jié)果

使用Design expert 7.0軟件對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken設(shè)計實驗的回歸方程分析和方差分析

R2=0.9636，R2(adj)=0.9267

由表6可知，模型Prob>F值小于0.001,說明模型極為顯著；變量A′、B′的Prob>F值小于0.001，極為顯著；變量C′顯著(Prob>F值小于0.05)；交互項A′C′極為顯著(Prob>F值小于0.01)；虛擬變量不顯著。說明此模型選擇較為合理，分析結(jié)果較為可靠?；貧w方程的決定系數(shù)R2=0.9636,說明96.36%的實驗數(shù)據(jù)可由回歸方程解釋，因此可用模型代替真實實驗點進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；貧w使用3-D Surface繪制響應(yīng)面三維曲線，如圖1所示。

圖1 各因素交互作用響應(yīng)面圖

由圖1可知，此響應(yīng)面的最高點在設(shè)計的模型范圍之內(nèi)，說明此響應(yīng)面的變量設(shè)計較好，可以進(jìn)行后續(xù)分析以求得響應(yīng)值最高點。

對實驗結(jié)果進(jìn)行二次回歸，得到響應(yīng)值擬合方程：DAP=180.20+0.037A′-1.63B′-1.76C′+5.03A′B′+1.05A′C′+2.98B′C′+2.20A′2-2.77B′2-0.45C′2，R2=0.9428。

利用軟件的Numerical optimization 功能預(yù)測響應(yīng)值最大值，模型各因素的組合為糊精7.0 g·L-1、可溶性淀粉6.66 g·L-1、L-天冬氨酸0.4 g·L-1,達(dá)托霉素最大產(chǎn)量預(yù)測值為186.0 mg·L-1。

2.4 驗證實驗

為了驗證Design expert 7.0軟件分析和預(yù)測結(jié)果的可信度，以預(yù)測響應(yīng)值的最大值所對應(yīng)的培養(yǎng)基組成為配方進(jìn)行實驗，同時以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作對照，結(jié)果見圖2。

圖2 優(yōu)化前后菌體生長及達(dá)托霉素產(chǎn)量

由圖2可知，優(yōu)化前后，培養(yǎng)基中各組分含量的變化對菌體生長的影響不太顯著,但優(yōu)化后穩(wěn)定期菌體的干重明顯升高。穩(wěn)定期是達(dá)托霉素的主要合成時期，高的菌體濃度有利于達(dá)托霉素的合成，因此，由圖中曲線可以看到，培養(yǎng)基優(yōu)化后，達(dá)托霉素的產(chǎn)量顯著上升，由優(yōu)化前的106.7 mg·L-1最高可升到185.3 mg·L-1，提高了73.7%。這可能是由于，優(yōu)化后的培養(yǎng)基使達(dá)托霉素合成和菌體生長有更好的平衡關(guān)系，使底物抑制作用降低，同時可以更好地為達(dá)托霉素的合成提供前體物質(zhì)。

3 結(jié)論

采用Plackett-Burman 設(shè)計、最陡爬坡設(shè)計與響應(yīng)面設(shè)計相結(jié)合的優(yōu)化方法，使用Design expert 7.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到了達(dá)托霉素的優(yōu)化培養(yǎng)基中糊精、可溶性淀粉、L-天冬氨酸的濃度分別為7.0 g·L-1、6.66 g·L-1、0.4 g·L-1，在此條件下，達(dá)托霉素的產(chǎn)量達(dá)到185.3 mg·L-1，比優(yōu)化前的106.7 mg·L-1提高了73.7%。

參考文獻(xiàn)：

[1] Canepari P，Boaretti M，Lleó M M，et al.Lipoteichoic acid as a new target for activity of antibiotics：Mode of action of daptomycin(LY146032)[J].Antimicrob Agents Chemother，1990，34(6)：1220-1226.

[2] Enoch D A，Bygott J M，Daly M L，et al.Daptomycin[J].J Infect，2007，55(3)：205-213.

[3] Jeu L，F(xiàn)ung H B.Daptomycin：A cyclic lipopeptide antimicrobial agent[J].Clin Ther，2004，26(11)：1728-1757.

[4] Walsh C T，F(xiàn)ischbach M A.Natural products version 2.0：Connecting genes to molecules[J].J Am Chem Soc，2010，132(8)：2469-2493.

[5] Sauermann R，Rothenburger M，Graninger W，et al.Daptomycin: A review 4 years after first approval[J].Pharmacology,2008，81(2)：79-91.

[6] Tanyildizi M S，Ozer D,Elibol M.Optimization ofα-amylase production byBacillussp.using response surface methodology[J].Process Biochem，2005，40(7):2291-2296.

[7] Tari C，Genckal H，Tokatli F.Optimization of a growth medium using a statistical approach for the production of an alkaline protease from a newly isolatedBacillussp.L21[J].Process Biochem，2006，41(3)：659-665.

[8] Miller A，Sitter R R.Using the folded-over 12-run Plackett-Burman design to consider interactions[J].Technometrics，2001，43(1)：44-54.

[9] Myers R H.Response surface methodology：Current status and future directions[J].J Qual Technol，1999，31(1):30-44.

[10] Bezerra M A，Santelli R E，Oliveira E P，et al.Response surface methodology(RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry[J].Talanta，2008，76(5)：965-977.

[11] 盧文玉，聞建平，范晶華，等.癸酸抗性突變株流加發(fā)酵法生產(chǎn)達(dá)托霉素[J].天津大學(xué)學(xué)報，2006，39(B06)：20-24.

[12] Chen Xiao-Chun，Bai Jian-Xin，Cao Jia-Ming，et al.Medium optimization for the production of cyclic adenosine 3′，5′-monophosphate byMicrobacteriumsp.no.205 using response surface methodology[J].Bioresource Technology，2009，100(2)：919-924.

[13] Muralidhar R V，Chirumamila R R，Marchant R，et al.A response surface approach for the comparison of lipase production byCandidacylindraceausing two different carbon sources[J].Biochem Eng，2001，9(1):17-23.