馬利青，王戈平，衣翠玲，蔡其剛，陸 艷，葉成玉，牛小迎，李曉卉

（青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 810016）

吉氏巴貝西蟲（Babesia gibsoni）是一種蜱媒傳播血細胞性原蟲，能夠導致犬的巴貝西蟲病。急性病例最常見的臨床癥狀為發(fā)熱、貧血、黃疸、食欲不振、饑渴、孱弱、虛脫，通常導致死亡［1］。幼齡犬和老齡犬對B.gibsoni都易感，但是幼齡犬更易感，感染后癥狀更嚴重［2］。犬B.gibsoni的診斷主要是基于血涂片的紅細胞內的B.gibsoni蟲體的檢查。然而，由于寄生蟲血癥水平低，其不適用于檢測隱形或慢性感染，有時在紅細胞內發(fā)現B.gibsoni蟲體是非常困難［3］?；诟腥炯t細胞作為抗原的間接熒光抗體檢測（IFAT）或者酶聯免疫吸附試驗（ELISA）在B.gibsoni診斷中也具有一定的特異性［4-5］。因此，利用B.gibsoni特異性抗原建立可靠的、敏感的和特異的檢測方法是非常必要的。

尋找用于作為犬B.gibsoni診斷抗原的焦點集中在免疫優(yōu)勢抗原的鑒定，這些抗原能夠被來自于地理區(qū)域隔離較遠、急和慢性感染的犬的血清所識別。最近，Fukumoto等已經鑒定了一個新的基因，該基因編碼B.gibsoni的主要免疫抗原P50，并對其在ELISA中的診斷潛力做了評估［6-7］。利用大腸桿菌表達重組全長的P50（P50f）作為抗原的ELISA方法能夠顯著區(qū)分B.gibsoni和B.canis感染犬或未感染的犬［7］。由于重組的P50f幾乎完全以不溶性的形式表達，有限的抗原的供應阻礙了本ELISA方法的使用。為了解決這個問題，在本次調查中通過去除高疏水性的信號肽和跨膜區(qū)在大腸桿菌中表達了可溶性的P50，并評價了其在ELISA中的診斷潛力。

1 材料與方法

1.1 重組的B.gibsoni GST-P50t 蛋白在以前的研究中進行了克隆、表達和純化［6］；陰、陽性標準血清，均為日本國家原蟲中心玄學南博士惠贈，青海省畜牧獸醫(yī)科學院獸醫(yī)所生物技術研究室保存。

1.2 被檢血清的采集和處理

1.2.1 118份血清樣品均來自西寧地區(qū)5個藏獒養(yǎng)殖基地的藏獒，其中：青海雪域獒園50份；青海圣地獒園11份；青海藏獒園12份；青海三哥獒園20份；青海建寧獒園21份。

1.2.2 采血時均空腹、橈靜脈采集，采集后擺成斜面，置4℃冰箱5h后，放在室溫待血清析出后收集血清，-20℃ 冷凍保存待檢。

1.3 其他試劑和耗材 均購自國內和Sigma公司供應商。

1.4 ELISA方法

1.4.1 抗原的包被 重組的B.gibsoni的GSTP50t和GST抗原，按5μg／mL劑量加到包被液中（50mmol／L carbonate-bicarbonate Buffer，pH 值9.6），混勻后加到96孔平底微量板（Nunc，Denmark）的孔里，每孔50μL，并且在4℃條件下培養(yǎng)過夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween-20的PBS沖洗液沖洗1次后，殘留的粘附物的部位用含3%脫脂乳的封阻液進行封阻，每孔100μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1h。

1.4.3 加樣 隨后微量板用沖洗液沖洗1次，在封阻液中按1∶100滴度稀釋被檢血清后，每個樣品平行加到微量板的兩個孔中，每孔50μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1h。

1.4.4 加二抗 用沖洗液沖洗6次后，在封阻液中按1∶4000滴度稀釋辣根過氧化物酶結合了山羊抗狗的IgG 抗體（Bethyl Laboratories，USA），稀釋后每孔加50μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1h。

1.4.5 底物 用沖洗液沖洗6次后，每孔加100 μL底物，每mL底物中含有0.3mg的1，2′-azinobis（3-ethylbenz-thia zoline-6-sulfonic acid），0.1 mol／L檸檬酸，0.2mol／L磷酸緩沖液和0.003%H2O2，每孔加100μL。

1.4.6 讀數 用Wellscan MK 3酶標讀數儀（Labsystems Dragon，Finland）在光吸收值OD415nm條件下測定光吸收值。

1.4.7 判定標準 ELISA滴度表示成最大稀釋度的倒數，且展示ELISA值是等于或大于0.2，在抗原GST-NcSAG1t孔和GST孔之間的光密度吸收值是不同的，兩個孔之間的差值為該被檢樣品的光密度吸收值（OD值）。兩孔陽性血清對照孔的平均值必須大于0.2；兩孔陰性血清對照孔的平均值必須低于0.2；兩孔待檢樣品的平均值等于或大于0.2為陽性，低于0.2為陰性。

2 結果

2.1 所檢測的118份被檢血清中，共檢出B.gibsoni抗體陽性血清12份，陽性率為10.17%。其中，檢青海雪域獒園54份，檢出陽性7份，陽性率為12.96%；青海圣地獒園11份，檢出陽性2份，陽性率為18.18%；青海藏獒園12份，檢出陽性1份，陽性率為8.33%；青海三哥獒園20份，未檢出陽性，陽性率為0%；青海建寧獒園21份，檢出陽性2份，陽性率為9.52%。結果見表1。

表1 ELISA檢測結果 （只、%）

2.2 從本次的檢測結果來看，初步說明青海省西寧地區(qū)藏獒群中存在B.gibsoni感染。

3 討論

3.1 B.gibsoni表面抗原P50是用于研究犬巴貝西蟲病診斷的一個重要的候選蛋白抗原。為了建立臨床上實用的有效的診斷方法，克隆了截頭的P50（P50t）基因，該基因缺乏信號肽和C末端疏水區(qū)域，并在大腸桿菌中表達帶有谷胱甘肽轉移酶（GST）標簽的融合蛋白。表達的GST-P50t超過90%是以可溶性的形式存在的。相反，GST-P50f（全長）幾乎全部以不溶性的形式表達。結果證明，去除疏水性的信號肽和C-末端大大提高了它的親水性。純化的GST-P50t用于ELISA檢測犬B.gibsoni的抗體。利用GST-P50t的ELISA方法能夠明確的區(qū)分B.gibsoni感染和未感染的犬的血清［8］。

3.2 ELISA檢測其與B.canis canis、B.canis vogeli、B.canis rossi、N.caninum 和L.infantum 間沒有交叉反應性［9］。從國內收集的田間血清樣本，利用ELISA診斷檢查其B.gibsoni感染，犬的血清陽性率為4.8%。從中國收集的所有的家犬的陽性血清樣本利用IFAT檢測均為陽性［10］。

3.3 隨著人們生活水平的日益提高，藏獒在人們的生活中越來越受歡迎，主要作為伴侶動物和身份的象征來飼養(yǎng)，逐漸成為他們日常生活中的一部分。藏獒通過舔舐主人的臉、手等部位，親密接觸后，而將B.gibsoni傳染給主人的幾率加大?？刂乞缑絺鞑ネ緩?，認為是減少該病發(fā)病率的一種簡單易行的方法。

3.4 建議各藏獒養(yǎng)殖基地應把犬的巴貝西蟲病的檢疫檢測工作納入到日常工作日程中，切實做好藏獒、養(yǎng)殖人員和業(yè)主們的巴貝西蟲病的檢疫，發(fā)現陽性犬應及時按照有關規(guī)定進行處理，控制傳染源，切斷傳播途徑；對養(yǎng)殖人員或業(yè)主檢出陽性者，嚴禁再與養(yǎng)殖基地接觸，同時做好他們的治療工作。

3.5 B.gibsoni在青海經蜱媒傳播的具體數據暫時不清楚的，因此有必要進行確定，蜱媒如何傳播到該地區(qū)牧羊犬的。本次工作對我們今后開展該領域流行病學調查，打下了良好的基礎。

［1］Boozer A L，Macintire D K.Canine babesiosis［J］.Vet Clin Small Anim，2003，33：885-904.

［2］De Waal D T.Global importance of piroplasmosis［J］.J Protozool Res，2000，10：106-27.

［3］Yamane I，Conrad P，Gardner I.Babesia gibsoni infections in dogs［J］.J Protozool Res，1993，3：111-125.

［4］Bose R，Jorgensen W K，Dalgliesh R J，et al.Current state and future trends in thedisgnosis of babesiosis［J］.Vet Parasitol，1995，57：61-74.

［5］Yamane I，Thomford J W，Dubey J P，et al.Evaluation of the indirect fluorescent antibody test for diagnosis of Babesia gibsoni infections in dogs［J］.Am J Vet Res，1993，54：1579-1584.

［6］Fukumoto S，Xuan X，Kadota K，et al.High-level expression of truncated surface antigen P50of Babesia gibsoni in insect cells by baculovirus and evaluation of its immunogenicity and antigenicity［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2003，10：596-601.

［7］Fukumoto S，Sekine Y，Xuan X，et al.Serodiagnosis of canine Babesia gibsoni infection by enzymelinked immunosorbent assay with the recombinant P50expressed in Escherichia coli［J］.J Parasitol，2004，90：387-391.

［8］Ikadai H，Tanaka H，Shibahara N，et al.Molecular vidence of infections with Babesia gibsoni parasites in Japan and valuation of the diagnostic potential of a loop-mediated isothermal amplification method［J］.J Clin Microbiol，2004，42：2465-2469.

［9］Inokuma H，Yoshizaki Y，Matsumoto K，et al.Molecular survey of Babesia infection in dogs in Okinawa［J］.Japan Vet Parasitol，2004，121：41-346.

［10］Yamane I，Conrad P，Gardner I.Babesia gibsoni infections in dogs［J］.J Protozool Res，1993，3：111-125.