楊仕群，陽 剛

(四川省宜賓職業(yè)技術學院，四川宜賓 644003)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，高密度養(yǎng)殖、水質的惡化使養(yǎng)殖的水產(chǎn)動物疾病頻發(fā)，抗生素使用范圍和用量不斷增加，不僅污染了水環(huán)境，而且對人類的健康造成了威脅。

氣單胞菌在細菌分類上屬于弧菌科氣單胞菌屬，嗜水單胞菌是其中一種，廣泛分布于池水、淤泥等自然環(huán)境[1-2]。嗜水氣單胞菌可引起淡水魚類及蛙、鱉等多種水產(chǎn)動物的敗血癥和人類腹瀉，往往給淡水養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。目前，其主要的治療方法為應用各類抗生素，但隨著長時間的應用抗生素，導致水產(chǎn)品藥物殘留及病原菌的耐藥性逐漸加強的問題日益突出。而中草藥是天然藥物，因其具有無抗藥性、無殘留、無副作用、無環(huán)境污染、不引發(fā)藥源性疾病，且抑菌殺菌效果明顯，備受人們關注[3-5]。本研究在單味中草藥抑菌的基礎上，初步篩選了12種中草藥組成5個復方，旨在為草魚細菌性敗血病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病原菌 病原菌是從患典型細菌性敗血癥的草魚肝臟中分離的，經(jīng)純化并測定其毒力后由宜賓職業(yè)技術學院微生物實驗室鑒定為嗜水氣單胞菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g，蛋白胨 10.0g，氯化鈉 5.0g，瓊脂 20g。

1.1.3 中藥 實驗選用文獻已報道或臨床應用的水產(chǎn)常用中草藥，由不同單方藥物配組構成多個復方，主要成分為五倍子、烏梅、黃連、黃芩、訶子等。試驗用藥購于宜賓市醫(yī)藥公司。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備 將中藥先在干燥箱內(40℃)烘干，用粉碎機打成粉狀，按設計復方(編號：A、B、C、D、E)稱取粉狀原料，混合均勻備用。稱取復方中草藥各20g，分別放至燒杯加蒸餾水煎煮三次，每次30min，用精密濾紙過濾去渣，將藥液濃縮至1：20濃度，抽濾除菌后作為實驗母液。再用無菌生理鹽水將藥液稀釋至設計的濃度(參照各藥的MBC)。

1.2.2 菌懸液的制備 少量的液體培養(yǎng)基接種嗜水氣單胞菌后震蕩培養(yǎng)12～16h。菌液培養(yǎng)好后用液體培養(yǎng)基稀釋到合適濃度。本實驗中菌液濃度為1×107個／mL。

1.2.3 復方中草藥抑菌定性試驗 固體培養(yǎng)基平板直徑約90.0mm，培養(yǎng)基厚度約3.6mm，在平板上均勻涂布100ul嗜水氣單胞菌懸液；待菌干后，分別貼上用直徑為6.0mm無菌濾紙片沾各復方藥母液后制成的紙片，并設無菌生理鹽水為對照，放在恒溫箱內(28℃)培養(yǎng)24 h后，觀察并用游標卡尺測量抑菌圈。

1.2.4 復方中草藥抑菌MIC及MBC的測定 參照陳學年[6]等的試驗方法進行，即采用96孔板微量雙倍稀釋法(共8排，每排12個孔，孔底呈U形，每孔容量為0.25ml，各孔先加50ul普通肉湯培養(yǎng)液，然后用微量移液器吸取50ul中藥母液至第1個孔，混合均勻后又從第1孔吸取50ul至第2孔，依次類推雙倍稀釋至第11孔，最后從第11孔吸取50ul棄去，第l2孔不加藥液作為對照)，將各復方藥稀釋成不同濃度梯度，接種嗜水氣單胞菌(50ul)后放在恒溫箱內(28℃)培養(yǎng)24h，觀察記錄 (黑背景下觀察剛澄清透明者)最低抑菌濃度(MIC)，在此基礎上再培養(yǎng)24h觀察記錄，確定最低殺菌濃度(MBC)。

2 結果

2.1 復方中草藥抑菌定性實驗結果 用于試驗的五個復方中，A對嗜水氣單胞菌有很強的抗菌作用。C、D有中等程度的抗菌作用，其余復方抗菌作用較弱。結果見表1。

表1 五種復方中草藥抑菌結果

2.2 復方中草藥抑菌MIC及MBC測定結果 對A、B、C、D、E 五組中草藥的對嗜水氣單胞菌的MIC及MBC分別進行測定，結果見表2。

表2 五種復方中草藥MIC及MBC測定結果

表2結果顯示，A、B、C、D、E 5組復方中草藥對嗜水氣單胞菌的MIC分別為25mg/L、98mg/L、49mg/L、49mg/L、195mg/L；MBC分別為 49mg/L、195mg/L、98mg/L、98mg/L、391mg/L。

3 討論

本試驗5組復方中草藥對嗜水氣單胞菌進行體外抗菌試驗研究，發(fā)現(xiàn)A、C、D三組復方中草藥對嗜水氣單胞菌的抑菌和殺菌效果最好，這與陳學年等[6]的研究結果相似。該三組復方中草藥主要成分為五倍子、黃連、黃芩等，主要以清熱解毒功效為主，性寒；而嗜水氣單胞菌引起的細菌性敗血癥多發(fā)生在高溫季節(jié)，屬于“熱性病”，“熱者寒之”和“熱病寒藥”的中醫(yī)辨證治療理論在此得到驗證。

[1]張海賓，楊桂芳.12種中草藥對嗜水氣單胞菌殺傷能力的研究[J].水產(chǎn)科學，2006，25（1）：16-18..

[2]曹紅峰，宋靖芳，李國慶等.中草藥對嗜水氣單胞菌ST-3-3抑菌作用的研究[J].中醫(yī)藥導報，2007，13（5）：86-88.

[3]王文博，汪建國，李愛華，等.中草藥應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究概況[J].中國水產(chǎn)，2006，7：60-61.

[4]向梟，周興華.中草藥添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應用[J].糧食與飼料工業(yè)，2000，3：27-29.

[5]曹紅峰，黃文芳，宋靖芳.中草藥防治魚病研究進展[J].海洋科學，2006,30(4):83-87.

[6]陳學年，郭玉娟.中草藥防治鯽魚敗血癥試驗[J].淡水漁業(yè)，2001，31（1）：43-45.