李環(huán)，蘇云明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，具有高死亡率，高致殘率的特點(diǎn)。目前肺癌的治療并未取得理想的效果。而中藥及復(fù)方有效地補(bǔ)充了常規(guī)治療的缺陷［1－2］。靈芪膠囊是一種中藥復(fù)方制劑，具有很好的抗癌作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，由黑龍江省藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供，符合實(shí)驗(yàn)要求，體質(zhì)量(22±2)g，雌雄各半，合格證號(hào):黑動(dòng)字第P00101006號(hào)。

1.2 實(shí)驗(yàn)瘤株

小鼠實(shí)體型移植肉瘤180(S180)，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.3 藥物

靈芪膠囊(靈芝、黃芪、綿馬貫眾、重樓、山慈菇、人參、山藥、枸杞、五味子、茯苓組成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室提供。每粒膠囊含生藥約1.65g，實(shí)驗(yàn)時(shí)臨時(shí)配制成溶液);復(fù)方環(huán)磷酰胺片(天津金世制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H12021006)。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái);電子天平;真彩色病理圖像分析系統(tǒng);微量加樣器;輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

造模成功之后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組，每組10只，實(shí)驗(yàn)分組及其給藥劑量如下:靈芪膠囊高劑量組(5.00g/kg)，靈芪膠囊中劑量組(2.50g/kg)，靈芪膠囊低劑量組(1.25g/kg)，靈芪膠囊中劑量+復(fù)方環(huán)磷酰胺組，模型對(duì)照組(同等容積0.9%Nacl)，陽性對(duì)照組給予復(fù)方環(huán)磷酰胺片(39mg/kg)。于接種瘤株24h后分組，為灌胃給藥，給藥時(shí)間為連續(xù)21天。

2.2 電鏡觀察瘤組織的組織形態(tài)學(xué)

超凈操作臺(tái)內(nèi)抽取傳代7f、生長狀態(tài)良好的S180荷瘤小鼠的腹腔積液，在冰盤上進(jìn)行操作，以無菌生理鹽水按照1∶3的比例進(jìn)行稀釋，按體積0.2ml/只接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右前肢腋部皮下，注射前先行常規(guī)消毒。24h后給藥，給藥時(shí)間為連續(xù)11天，停藥后，第二天稱取小鼠體重，然后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，手術(shù)取出取瘤塊，進(jìn)行固定。

取材與固定:將正常生長的瘤塊打碎成為組織勻漿液，用PBS緩沖液洗滌3次，最后一次將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5ml的 EP管中，在低溫高速離心機(jī)中離心，12 000rpm，－4℃，5min，去除上清液，立即轉(zhuǎn)入固定液(2%戊二醛液均可)pH值7.2，4℃固定時(shí)間約4h。

倒掉固定液，用0.1M，pH值7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15min;用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2h;倒掉固定液，用0.1M，pH值7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15min;應(yīng)徹底漂洗干凈，減少固定液與固定液或與脫水劑之間的反應(yīng)。

丙酮梯度脫水:脫水是將組織中的游離水徹底清除的過程。由于常用的包埋劑大都是非水溶性樹脂，只有將生物組織中的游離水清除干凈，包埋劑才能浸入組織。丙酮梯度脫水濃度配比見表1。

表1 丙酮梯度脫水濃度配比

脫水過程中應(yīng)注意:逐級(jí)脫水而不能急劇脫水;更換溶液時(shí)動(dòng)作要快，特別是不要讓組織離開溶液，否則會(huì)在組織內(nèi)外產(chǎn)生氣泡;脫水過程中若要長時(shí)間停留或過夜，應(yīng)放在70%脫水劑中，并在4℃保存。

包埋與滲透:滲透就是用包埋劑逐漸取代組織中的脫水劑，使細(xì)胞內(nèi)外空隙被包埋劑所填充。包埋劑通常由樹脂、硬化劑、增塑劑及催化劑4種試劑按一定比例配制而成。

把細(xì)胞塊放入包埋模具的頂端，再放入實(shí)驗(yàn)標(biāo)簽，然后加入包埋劑。包埋劑配制及使用過程中的注意事項(xiàng):所有容器及玻璃棒等應(yīng)是清潔和干燥的;配制過程中應(yīng)攪拌均勻，使用過程中應(yīng)避免異物，特別是水、乙醇、丙酮等混入包埋劑;配制好的包埋劑應(yīng)密封保存，避免受潮。剩余包埋劑可密封并儲(chǔ)存在－10℃ ～－20℃冰箱中，延長其使用期。

聚合:37℃烘箱內(nèi)過夜，45℃烘箱內(nèi)12h，60℃烘箱內(nèi)24h。

標(biāo)本的修整:將細(xì)胞塊從溫箱中取出，用修塊機(jī)修整，曝露細(xì)胞，在用修塊機(jī)或刀把曝露出的細(xì)胞團(tuán)修整成45°角立體梯形。

半薄切片的制備:把包埋后修整好的細(xì)胞團(tuán)，切成厚度 0.5 ～1.0μm，最大切片面積 2mm2，目的是補(bǔ)充光鏡下所觀察的內(nèi)容，定位制備超薄切片。

超薄切片的定位:超薄切片的面積為0.55mm2，因此在進(jìn)行超薄切片前必須將細(xì)胞團(tuán)細(xì)切，盡量保留所要觀察的部位，但保留的部位不能太大，否則影響切片質(zhì)量。

載網(wǎng):將切片附在金屬載網(wǎng)膜面上。

2.3 醋酸鈾－枸櫞酸鉛雙染色 電子染色法是利用重金屬于細(xì)胞的密歇成分結(jié)合或吸附，在電子束的照射下，樣品形成不同的散射能力，而提高了圖像的反差。

3 結(jié)果 見圖1。

圖1 電鏡觀察瘤組織的組織形態(tài)學(xué)圖片(11 500×)

空白對(duì)照組:細(xì)胞多呈現(xiàn)圓形，表面有大小不等的突起和長短不一的絨毛，核形不規(guī)則，核仁清晰。胞漿雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，可見線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，游離核糖體。核膜輕度生理性皺縮，細(xì)胞表面可見微絨毛和較大突起。

靈芪膠囊高劑量組:部分細(xì)胞胞漿空泡變性，部分細(xì)胞固縮壞死。胞漿內(nèi)可見大小不等的空泡狀結(jié)構(gòu)，線粒體髓樣變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯減少，雙層膜結(jié)構(gòu)不清晰。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒。細(xì)胞膜破損，細(xì)胞核腫脹，異染色質(zhì)邊集，線粒體空泡變性，大部分線粒體腫脹。細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊，核膜不清晰，細(xì)胞膜破損。

靈芪膠囊中劑量組:大部分細(xì)胞崩解壞死，異染色質(zhì)邊集，細(xì)胞體成凋零狀。胞漿內(nèi)可見大量的自噬體，細(xì)胞膜不清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，游離核糖體明顯減少。部分線粒體腫脹，部分線粒體嵴融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，游離核糖體減少。細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊。細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞突起明顯減少，細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞器膜性結(jié)構(gòu)融合。部分細(xì)胞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)消失，胞漿內(nèi)殘存少量游離核糖體。

靈芪膠囊低劑量組:細(xì)胞膜，核膜清晰，突起，微絨毛明顯減少。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脫顆粒，可見自噬體。核膜結(jié)構(gòu)清晰，線粒體明顯腫脹，核糖體減少。

陽性對(duì)照組:部分細(xì)胞崩解壞死，部分細(xì)胞核異染色質(zhì)邊集，核膜結(jié)構(gòu)不清。核膜結(jié)構(gòu)清晰，可見線粒體結(jié)構(gòu)完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，游離核糖體。雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，線粒體豐富，有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，游離核糖體。細(xì)胞多呈圓形，核膜曲度變大，核仁清晰。核膜結(jié)構(gòu)清晰，線粒體膜完整，線粒體結(jié)構(gòu)尚正常。自噬體，為用藥導(dǎo)致細(xì)胞器損傷。部分細(xì)胞漿內(nèi)可見大小不等的空泡。核膜雙層膜結(jié)構(gòu)消失融合，線粒體空泡變性，部分細(xì)胞凋零樣變性。

4 結(jié)論

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示，靈芪膠囊可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡及壞死，并引發(fā)相應(yīng)的炎細(xì)胞反應(yīng)。

［1］王重洋，關(guān)欣，宋武元，等.艾迪注射液聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌臨床觀察［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(2):43 －44.

［2］楊靜.淺談肺癌從脾胃論治［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(3):144－146.