薛秀霞

(利津縣食品藥品監(jiān)督管理局，山東利津257400)

治療用生物大分子，包括多肽、蛋白、酶、激素、單克隆抗體等，因其具有獨(dú)特的藥理作用而成為當(dāng)今醫(yī)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，近年來相關(guān)的研究報(bào)道和上市產(chǎn)品也急劇增多，為生命科學(xué)的發(fā)展，尤其是癌癥、慢性疾病的治療帶來了新的希望。但是，這些生物大分子作為機(jī)體的外源性物質(zhì)，不可避免地會(huì)激活機(jī)體自身的免疫反應(yīng)，比如形成針對藥物的抗體、激活T細(xì)胞或內(nèi)源性免疫反應(yīng)等，從而減小藥物療效，甚至可能產(chǎn)生危及生命的毒副作用。如何合理地預(yù)測、減小及檢測治療用生物大分子的免疫原性是相關(guān)研究人員普遍關(guān)注的問題。本文從影響因素、改善措施、檢測手段等方面對生物大分子的免疫原性進(jìn)行綜述，以期對相關(guān)研究有所幫助。

1 影響生物大分子免疫原性的因素

影響生物大分子免疫原性的因素有很多，按照產(chǎn)生的原因可分為患者相關(guān)、給藥相關(guān)及藥物相關(guān)的因素［1］。

1.1 患者因素 患者因素包括調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的遺傳因素、免疫缺陷相關(guān)的遺傳因素和年齡?；颊叩倪z傳因素可以改變機(jī)體對藥物的免疫反應(yīng)，基因的多態(tài)性可能會(huì)影響機(jī)體與生物大分子的相互作用，從而引起免疫相關(guān)的毒副作用［2］。健康的個(gè)體對天然蛋白具有一定的耐受性，同時(shí)能夠識(shí)別自身蛋白，但是免疫缺陷患者對這些蛋白可能缺乏正常的免疫耐受性，從而更有可能產(chǎn)生藥物相關(guān)的抗體［3］。另外，對用于兒童或老年患者的生物大分子來說，考慮到兒童免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟、老年患者免疫系統(tǒng)衰退的可能性，用藥時(shí)必須進(jìn)行相應(yīng)的免疫原性的測定。

1.2 給藥因素 給藥因素主要包括聯(lián)合用藥、給藥途徑、給藥劑量及給藥持續(xù)時(shí)間等。當(dāng)生物大分子藥物與其他藥物同時(shí)使用時(shí)，不能根據(jù)單個(gè)藥物使用時(shí)免疫原性的大小來推斷聯(lián)合用藥時(shí)出現(xiàn)免疫原性的可能性。此外，給藥方式對生物大分子的免疫原性也會(huì)產(chǎn)生一定的影響，與靜脈注射相比，皮下和肌肉注射更容易發(fā)生免疫反應(yīng)，一般認(rèn)為是由皮下或肌肉組織中存在較多的抗原遞呈細(xì)胞引起的，也可能是藥物在局部滯留時(shí)間較長的緣故［1］。

1.3 藥物因素 藥物因素是引起機(jī)體免疫原性的主要因素，生物大分子的序列差異、糖基化作用［4］、制備工藝等都會(huì)對其免疫原性產(chǎn)生影響［5～7］。對于非人源性生物大分子藥物，人體往往會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫原性，而且這種免疫原性一般會(huì)隨著蛋白同源性的減小而增強(qiáng)。蛋白的糖基化作用被認(rèn)為是一種減小免疫原性的方法。Karpusas等［8］將IFN－β糖基化后免疫原性有所降低，Gribben等［9］對rhGM－CSF進(jìn)行糖基化后也得到了類似的結(jié)果，推測可能是糖基側(cè)鏈遮蔽了生物大分子產(chǎn)生免疫原性的活性位點(diǎn)，但是Ilchmann等［10］將卵清蛋白糖基化后卻增加了它的T細(xì)胞免疫原性，其原因有待進(jìn)一步考證。為得到高純度、穩(wěn)定性好、安全、有效的蛋白產(chǎn)品，生物制品的生產(chǎn)一般要?dú)v時(shí)數(shù)月，包括宿主細(xì)胞的培養(yǎng)、原始細(xì)胞庫的建立及蛋白的生產(chǎn)、純化、分析、制劑、儲(chǔ)存等過程，這些過程中任何微小的改變都有可能改變藥物的有效性、毒性及免疫原性。生物大分子在生產(chǎn)過程中要經(jīng)過諸多復(fù)雜的步驟，每一步都有可能導(dǎo)致最終所得大分子的結(jié)構(gòu)的改變，蛋白在降解過程中可能產(chǎn)生具有更強(qiáng)免疫原性的抗原決定簇，從而增加其免疫原性;曾有報(bào)道無免疫原性的人血白蛋白作為干擾素α－2a的輔料時(shí)會(huì)導(dǎo)致蛋白的聚集及蛋白制劑的免疫原性的增加。此外，生物大分子生產(chǎn)過程中采用的容器也可能影響蛋白的免疫原性，玻璃容器的表面、氣液界面、潤滑劑等可以介導(dǎo)蛋白的變性，而塑料和橡膠中的鄰苯二甲酸酯可能會(huì)導(dǎo)致變應(yīng)原性的產(chǎn)生和免疫原性的增加。

2 減小生物大分子免疫原性的方法

治療用生物大分子引起的免疫原性不僅會(huì)減弱藥物的療效，而且有可能產(chǎn)生毒副作用，甚至危及生命，因此有必要采取一定的措施降低此類藥物的免疫原性。現(xiàn)有的減小生物大分子免疫原性的方法有:增加蛋白的人源序列，改善蛋白溶解特性，去除抗體表位，PEG化，鑒別和去除Ⅱ類MHC配位等。

2.1 增加人源序列 為減小鼠源生物大分子存在的人抗鼠抗體反應(yīng)，人們采用的方法有:以鼠的活性區(qū)和人的恒定區(qū)制備嵌合抗體，將鼠的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)接到人類抗體的骨架上制備人化抗體以及通過噬菌體展示技術(shù)或轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備完全的人類抗體。這幾種方法往往可以極大地減小生物大分子的免疫原性［11］。但是，即使是人類抗體也不能完全避免生物大分子類藥物免疫原性的產(chǎn)生，僅僅通過增加人源化序列還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

2.2 改善溶解特性 蛋白的聚集體往往比蛋白本身的免疫原性要大得多，因此使蛋白聚合最小化、改善其溶解性可以有效地降低蛋白藥物的免疫原性，一般認(rèn)為蛋白的溶解性問題可以通過優(yōu)化表達(dá)、純化、制劑、溶解的條件來解決，但是與聚集相關(guān)的免疫原性問題有時(shí)卻相當(dāng)棘手［11］。

2.3 去除抗體表位 去除抗體表位是較為理想的方法，抗體表位一般位于蛋白表面的少數(shù)幾個(gè)不連續(xù)位點(diǎn)上，僅僅幾個(gè)殘基就有可能具有很強(qiáng)的抗體結(jié)合親和力，對這些抗體表位的關(guān)鍵殘基進(jìn)行修飾可減小其親和力。例如，通過去除B細(xì)胞表位可有效減小非人源蛋白引起的免疫原性，靶向于CD22和CD25的免疫毒素對耐藥性毛樣細(xì)胞白血病及其他惡性腫瘤產(chǎn)生了完全的緩解作用。但免疫細(xì)胞抗體表位的鑒別也是極為困難的事情［12］。最近發(fā)展的T細(xì)胞表位定位工具有助于鑒別、修飾與免疫原性相關(guān)的T細(xì)胞表位，為去除抗體表位提供了新的希望［13］。然而，多次使用這種變異蛋白也可能產(chǎn)生針對新的表位的免疫反應(yīng)。

2.4 PEG化 蛋白的PEG化可通過增加蛋白的溶解性和減少用藥次數(shù)來減小免疫原性。PEG化可有效減小治療酶如精氨酸酶、天冬酰胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶的免疫原性，因?yàn)镻EG化阻礙了抗體的結(jié)合但并不妨礙小分子底物的擴(kuò)散。但對于其他生物大分子而言，阻礙抗體的結(jié)合位點(diǎn)和保留受體結(jié)合位點(diǎn)往往不能兼顧。以重組人角質(zhì)化細(xì)胞生長因子2(rhKGF－2)為例，rhKGF－2的N端PEG化后免疫原性顯著減小，但是其有絲分裂促進(jìn)活性也下降了約40%［14］。An QX等［15］也發(fā)現(xiàn)，PEG化后天花粉蛋白的免疫原性降低4倍左右，血漿中半衰期延長為原來的6倍，但也同樣存在蛋白活性降低的問題。

2.5 鑒別和去除Ⅱ類MHC配位 通過鑒別和去除生物大分子的Ⅱ類MHC配位，可以避免與免疫原性相關(guān)的高親和性IgG抗體的產(chǎn)生。相對于去除抗體表位而言，去除Ⅱ類MHC配位來降低免疫原性的方法更為可行，因?yàn)橛绊懡Y(jié)合的因素更確定，結(jié)合位點(diǎn)的變化小得多，MHC分子及其結(jié)合專一性較為恒定。通過計(jì)算和實(shí)驗(yàn)的方法鑒別MHC配位后，可以采用誘發(fā)突變的方法產(chǎn)生不與MHC相互作用的變異序列，但通過實(shí)驗(yàn)的方法來選擇免疫原性低的序列的效率較低，獲得的較為理想的序列十分有限，而采用合理的蛋白設(shè)計(jì)方法如蛋白設(shè)計(jì)自動(dòng)化(PDA)技術(shù)等可以發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定、活性好、免疫原性低的生物大分子［11］。

3 免疫原性的檢測方法

鑒于治療用生物大分子存在免疫原性的可能性，建立一種可行的方法來檢測、定量和表征機(jī)體的免疫反應(yīng)是相當(dāng)必要的?，F(xiàn)有的檢測免疫原性的方法主要有:酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、表面等離子體共振法(SPR)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISpot)、免疫PCR法(IPCR)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等，具體應(yīng)用哪一種檢測方法取決于生物大分子的類型及研究的目的［16］，而采用多種檢測方法和多種受試對象有助于提高檢測的準(zhǔn)確性［17］。

3.1 ELISA 在檢測免疫原性的各種方法中，ELISA因其能夠高選擇性、高靈敏度地檢測特異性抗體而最為常用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，常以ELISA測定IgG、IgE的水平作為免疫原性強(qiáng)弱的指標(biāo)［15］。臨床試驗(yàn)中，Phillips等［18］采用 ELISA 法測定了病人服用干擾素β－1a(Avonex)后血中的IgG水平，證明不含人血白蛋白(HAS)的載藥注射器劑型具有較低的免疫原性。

3.2 RIA RIA是利用放射性同位素標(biāo)記的抗原和非標(biāo)記抗原同時(shí)與數(shù)量有限的特異性抗體之間發(fā)生競爭性結(jié)合來測定免疫反應(yīng)的方法。RIA技術(shù)極其敏感而又極其特異，可用于測定生物樣品中抗體的含量［19］。但是RIA測定的指標(biāo)是放射性同位素的放射強(qiáng)度，對儀器的要求比較高，而且要采取必要的防輻射措施，因此該法的實(shí)際應(yīng)用不如ELISA普遍。

3.3 SPR SPR可以檢測濃度極低或親和力極小的抗體，是檢測抗體的極為有利的手段。Nechansky［20］對ELISA和SPR進(jìn)行了比較，認(rèn)為對于直接ELISA，使用人抗的檢測試劑不能用于人源化抗體的檢測;對于雙抗ELISA，必須精心優(yōu)化試劑的濃度，檢測試劑之間的反應(yīng)復(fù)雜，檢測過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力等。而SPR技術(shù)無需二抗就能實(shí)時(shí)檢測對某一配體的結(jié)合，靈敏度和選擇性優(yōu)于ELISA。除此之外SPR還可同時(shí)給出定性和定量的結(jié)果、可檢測結(jié)合抗體的等型，并適用于親和力小的抗體的檢測。SPR操作簡單、檢測快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)在檢測復(fù)雜生物樣品中發(fā)揮著重要的作用［21，22］，但SPR昂貴的價(jià)格也極大地限制了其應(yīng)用。

3.4 ELISpotELISpot的原理類似于ELISA，也是檢測細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白的方法，但它不僅能測定細(xì)胞因子生成量，還可通過計(jì)數(shù)檢測分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率，靈敏度要高于ELISA，而且實(shí)驗(yàn)采用的捕獲抗體不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，因而近年相關(guān)的報(bào)道也不斷增加［22，23］。

3.5 IPCR IPCR也是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起來的新方法，用PCR擴(kuò)增代替ELISA的酶催化底物顯色。PCR具有很強(qiáng)的放大能力，可以定量地檢測DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結(jié)合的特異抗體通過連接分子與DNA結(jié)合，再經(jīng)PCR擴(kuò)增定量檢測抗原使得IPCR的靈敏性高于ELISA。Spengler等［24］發(fā)現(xiàn)，與對應(yīng)的ELISA比較，IPCR至少可使抗體檢測的靈敏度提高1 000倍，而且本法中僅僅采用稀釋的方法就可以消除生物樣品中基質(zhì)的干擾。

3.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 與免疫相關(guān)的T細(xì)胞或B細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是免疫原性測定的又一方法。T細(xì)胞或B細(xì)胞的數(shù)量直接影響到它們釋放的細(xì)胞因子的數(shù)量，進(jìn)而影響機(jī)體的免疫反應(yīng)，因此以生物大分子特異性免疫細(xì)胞的數(shù)量作為免疫原性測定指標(biāo)的研究也多有報(bào)道［10］。

4 小結(jié)

隨著治療用生物大分子的廣泛研究和應(yīng)用，相關(guān)藥物的免疫原性也日益受到關(guān)注。生物大分子的免疫原性受到患者、給藥及藥物相關(guān)的多種復(fù)雜因素的影響，雖然至今尚不能完全解釋產(chǎn)生免疫原性的原因，但是一些減小免疫原性的切實(shí)可行的方法逐漸發(fā)展起來，如增加大分子的人源序列，去除抗體表位，PEG化等。同時(shí)，免疫原性的各種檢測方法也應(yīng)運(yùn)而生，如 ELISA、RIA、SPR、ELISpot、IPCR、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等技術(shù)使復(fù)雜生物樣品中含量極低的抗體的檢測得以實(shí)現(xiàn)。雖然人們在生物大分子的免疫原性弱化及檢測方面尚處于探索階段，但隨著不斷深入的理論認(rèn)識(shí)及日新月異的生物技術(shù)的發(fā)展，必將會(huì)開發(fā)出強(qiáng)效、穩(wěn)定以及免疫原性較弱的生物大分子藥物，治療用生物大分子藥物將擁有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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