李 強，郭學(xué)平，2，張?zhí)烀?/p>

(1．山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250012;2．山東福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，山東 濟南 250101;3．山東省生物藥物研究院，山東 濟南 250101)

透明質(zhì)酸應(yīng)用于干細(xì)胞培養(yǎng)的研究進(jìn)展

李 強1，郭學(xué)平1，2，張?zhí)烀?

(1．山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250012;2．山東福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，山東 濟南 250101;3．山東省生物藥物研究院，山東 濟南 250101)

透明質(zhì)酸是一種廣泛存在于細(xì)胞基質(zhì)中的大分子酸性黏多糖，是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，具有良好的生物相容性和力學(xué)特性，體內(nèi)可自行降解，同時通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合，直接影響組織構(gòu)建，促進(jìn)細(xì)胞遷移以及胞外基質(zhì)重構(gòu)。研究表明透明質(zhì)酸具有影響體外培養(yǎng)干細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、老化及分化的能力。本文對透明質(zhì)酸用于干細(xì)胞培養(yǎng)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

透明質(zhì)酸;干細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng);組織工程

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是由D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)二糖單位通過β-1，3或β-1，4糖苷鍵連接而成的線性高分子酸性黏多糖［1］。HA是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和細(xì)胞間基質(zhì)(ICM)的主要成分，是皮膚、玻璃體、關(guān)節(jié)滑液和軟骨組織的重要組成成分，具有獨特的理化性質(zhì)和生物功能［2］。它具有良好的潤滑性、黏彈性，并可通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合，引發(fā)一系列生理生化反應(yīng)，從而影響細(xì)胞的黏附、增殖、分化和移動。HA及其衍生物具有優(yōu)良的生物相容性和可降解性，可作為藥物媒介和組織工程材料，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［3］。在過去的十年，HA作為創(chuàng)建新型材料的組成部分用于細(xì)胞治療、三維細(xì)胞培養(yǎng)以及組織工程方面日益得到研究者的重視［4-7］，有關(guān)HA應(yīng)用于干細(xì)胞培養(yǎng)以及組織工程材料的研究逐年增多。

干細(xì)胞是指具有自我復(fù)制能力，可經(jīng)過不可逆的終末分化過程產(chǎn)生子代細(xì)胞的細(xì)胞，可以通過各種子代細(xì)胞、前體細(xì)胞的分化過程產(chǎn)生多種細(xì)胞表型［8］。根據(jù)細(xì)胞來源可將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)和成體干細(xì)胞(adult stem cell)。干細(xì)胞有著巨大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景，有可能作為“種子細(xì)胞”用于細(xì)胞替代療法，以治療各種難治性疾病。但是，干細(xì)胞經(jīng)體外長期培養(yǎng)后，其增殖活性和分化能力都會有所降低。如何使干細(xì)胞在體外不斷增殖的同時維持著不分化的狀態(tài)和分化的潛能以及如何誘導(dǎo)其向特定細(xì)胞類型分化，是將其用于臨床必須解決的問題。近年來研究表明，HA對體外干細(xì)胞培養(yǎng)有著十分重要的影響，展示了廣闊的應(yīng)用前景。

1 HA應(yīng)用于ESC培養(yǎng)

ESC是存在于早期胚胎組織中，具有高度增殖能力和多向分化潛能，能分化為三個胚層所有細(xì)胞類型的原始細(xì)胞。三維多孔的培養(yǎng)環(huán)境能有效地誘導(dǎo)ESC的定向分化，促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用，截留細(xì)胞分泌的ECM，同時有利于維持細(xì)胞的球形形態(tài)。HA水凝膠可以為細(xì)胞生長提供疏松多孔的三維結(jié)構(gòu)，同時還能與細(xì)胞表面受體結(jié)合，調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的分化［9］。

Gerecht等［10］研究了HA水凝膠對ESC增殖與分化的影響，發(fā)現(xiàn)HA與ESC保持未分化狀態(tài)有重要聯(lián)系。在傳統(tǒng)干細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中加入HA水凝膠，不僅可以維持ESC長期的體外增殖能力和未分化狀態(tài)，還能維持其遺傳完整性。向凝膠中加入透明質(zhì)酸酶水解一定時間后，ESC從凝膠中完全釋放出來，在條件培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間后轉(zhuǎn)入加入了血管內(nèi)皮生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞開始表現(xiàn)分化的狀態(tài)，顯示血管α-平滑肌肌動蛋白陽性，部分細(xì)胞呈早期內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD34受體陽性，說明ESC保持其分化的能力。

不同相對分子質(zhì)量(Mr)的HA對體外培養(yǎng)ESC全能性的保持以及增殖能力有不同的影響。Joddar等［11］研究發(fā)現(xiàn)，相對于高M(jìn)r(1 000×103)HA，低Mr(4～8×103)HA更有利于維持體外培養(yǎng)的小鼠ESC的存活及其未分化狀態(tài)。

2 HA 應(yīng)用于成體干細(xì)胞培養(yǎng)

成體干細(xì)胞指存在于各組織器官的未分化細(xì)胞，在體內(nèi)具有終生自我更新能力和分化潛能，且具有可塑性和橫向分化的特性。HA作為ECM的組成部分，具有良好的生物相容性，可作為各種干細(xì)胞體外培養(yǎng)的基質(zhì)。同時，HA支架具有良好的結(jié)構(gòu)和機械性能，在體內(nèi)可自行降解，在組織工程材料方面有廣泛的應(yīng)用前景。

2．1 HA應(yīng)用于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)

間充質(zhì)干細(xì)胞是具有自我增殖能力以及分化成多種細(xì)胞系的多功能干細(xì)胞，在不同的培養(yǎng)基、生長因子等因素的誘導(dǎo)下可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等中胚層來源細(xì)胞。近年來，HA作為非合成生物材料主要用于創(chuàng)建控制間充質(zhì)干細(xì)胞行為及向軟骨形成方向分化的媒介和微環(huán)境。

寇建強等［12］向兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入HA誘導(dǎo)液、軟骨誘導(dǎo)液和常規(guī)培養(yǎng)液，經(jīng)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)經(jīng)HA誘導(dǎo)后，細(xì)胞增殖速度減慢，表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的分化特點，但比軟骨誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)能力弱。因此HA可作為軟骨組織工程基質(zhì)使用，可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。Chung等［13］發(fā)現(xiàn)在短期體內(nèi)及體外培養(yǎng)中光致交聯(lián)的HA凝膠相比于惰性的聚乙二醇凝膠更能促進(jìn)軟骨基質(zhì)蛋白的表達(dá)，同時轉(zhuǎn)化生長因子β-3容易在HA水凝膠中傳遞以調(diào)節(jié)凝膠中間充質(zhì)干細(xì)胞的基因表達(dá)。

Garcia-Fuentes等［14］將絲心蛋白和HA的水溶液冷凍干燥后加入甲醇使其形成多孔微觀結(jié)構(gòu)的支架，其中HA作為優(yōu)良的致孔賦形劑使絲心蛋白支架在原制作工藝的基礎(chǔ)上更容易形成多微孔結(jié)構(gòu)。將間充質(zhì)干細(xì)胞接種于該蠶絲蛋白/HA支架培養(yǎng)3周，發(fā)現(xiàn)對比絲心蛋白支架，該支架明顯促進(jìn)細(xì)胞向支架內(nèi)生長。在培養(yǎng)過程中加入組織誘導(dǎo)刺激物，通過檢測黏多糖和I型和Ⅱ型膠原基因的表達(dá)，表明該新型支架可有效促進(jìn)組織形成。

2．2 HA應(yīng)用于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞移植是中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂如帕金森病等的潛在治療方法，然而治療效果常被移植細(xì)胞較低的生存能力所限制。近年來，研究了HA對神經(jīng)干細(xì)胞生長的影響，以期提高其生存能力并有助于誘導(dǎo)其分化。Zhang等［15］將神經(jīng)干細(xì)胞離體培養(yǎng)于加入了神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3的HA-膠原復(fù)合材料中，并將5-溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞導(dǎo)管植入到橫切的兔面神經(jīng)末端，肌電圖掃描結(jié)果表明HA-膠原復(fù)合材料可以促進(jìn)損傷面神經(jīng)的修復(fù)。人造神經(jīng)干細(xì)胞導(dǎo)管將有可能應(yīng)用于末梢神經(jīng)損傷的治療。而Wang等［16］通過冷凍干燥將HA與膠原蛋白混合制成HA-膠原蛋白支架，然后與水溶性的碳化二亞胺交聯(lián)以提高其機械穩(wěn)定性，從而制得一種類似于腦組織的具有開放多孔結(jié)構(gòu)以及相似機械特性的復(fù)合材料。他們將神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)體外擴大培養(yǎng)后植入該復(fù)合材料中，發(fā)現(xiàn)該材料在體外可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞的分化。

2．3 HA應(yīng)用于脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)

脂肪組織在體內(nèi)儲量豐富，有較強再生能力，取材創(chuàng)傷小，細(xì)胞可大量獲取。鑒于以上優(yōu)勢，脂肪來源的干細(xì)胞有望成為組織工程“種子細(xì)胞”之一，用于組織的重建、修復(fù)以及醫(yī)療美容等［17-18］方面。

Wu等［19］嘗試將脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)于HA覆蓋的培養(yǎng)平板和HA/乳酸-羥基乙酸共聚物(HA/PLGA)支架中。研究結(jié)果顯示，脂肪干細(xì)胞在HA覆蓋的培養(yǎng)孔板中培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞聚集體和相關(guān)mRNA表達(dá)量明顯增加，培養(yǎng)9 d后，黏多糖硫酸鹽含量也顯著提高。HA/PLGA沒有改變細(xì)胞黏附和存活，與PLGA支架相比，軟骨形成標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)量、黏多糖硫酸鹽和Ⅱ型膠原蛋白水平明顯提高。因此，HA富集微環(huán)境有利于人脂肪干細(xì)胞分化成軟骨。

Flynn等［20］將人脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)于胎盤去細(xì)胞基質(zhì)(PDM)和交聯(lián)HA支架中，在誘導(dǎo)其分化之前檢測細(xì)胞增殖、存活水平和葡萄糖的消耗量，并通過終點與實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測其基因表達(dá)進(jìn)而分析不同支架中脂肪形成的程度。結(jié)果顯示，細(xì)胞黏附的PDM支架促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活能力，而非黏附性的XLHA則明顯提高細(xì)胞的分化能力。

2．4 HA應(yīng)用于肝干細(xì)胞培養(yǎng)

從胎兒肝臟分離出的肝細(xì)胞、肝干細(xì)胞以及肝祖細(xì)胞體外培養(yǎng)前后均發(fā)現(xiàn)CD44受體的表達(dá)。這預(yù)示著其與HA存在著某些體內(nèi)聯(lián)系，為HA制備成的3D支架應(yīng)用于肝干細(xì)胞體外培養(yǎng)及分化提供了可能。Turner等［21］將肝祖細(xì)胞于加入了HA水凝膠的無血清已知成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)過4周的培養(yǎng)，在凝膠中形成細(xì)胞團塊并保持細(xì)胞的存活、增殖，表現(xiàn)出一種介于肝干細(xì)胞和成肝細(xì)胞之間的一種細(xì)胞表型，同時有少許證據(jù)顯示其限定于向肝或膽的分化方向。Lozo-ya等［22］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，人肝干細(xì)胞的分化方向決定于加入了HA水凝膠的培養(yǎng)基的硬度，該HA水凝膠與Kubota培養(yǎng)基(Kubota's medium)組成的培養(yǎng)系統(tǒng)很好的模擬了干細(xì)胞在體內(nèi)的3D生長環(huán)境，不僅支持肝干細(xì)胞的黏附、生存以及擴增，同時還能通過改變其機械硬度調(diào)節(jié)肝干細(xì)胞向多種肝祖細(xì)胞的分化方向。因而，HA水凝膠可作為肝干細(xì)胞理想的3D支架，在生產(chǎn)用于生物人工肝或組織工程肝的細(xì)胞方面有較大應(yīng)用前景。

3 結(jié)語與展望

在過去的十年中，應(yīng)用于組織再生的具有合適的架構(gòu)、分子大小可調(diào)，起臨時支撐作用的生物可降解大分子化合物的研究得到快速發(fā)展。與此同時，隨著干細(xì)胞的不斷深入研究及其廣泛的應(yīng)用前景，對干細(xì)胞的體外培養(yǎng)提出更高的要求。HA作為人體組織ECM的重要組成部分，具有良好的生物相容性，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的傳遞系統(tǒng)、細(xì)胞封裝和組織工程，基于HA的合成胞外基質(zhì)經(jīng)過濃度、組成以及結(jié)構(gòu)特性的優(yōu)化，可更廣泛的應(yīng)用于干細(xì)胞培養(yǎng)［23-24］。

HA在其單一溶液中的物理和生物特性，如水溶性、快速吸收以及較短的組織停留時間，限制了其作為生物材料的應(yīng)用，因此可嘗試修飾HA結(jié)構(gòu)以改變其物理化學(xué)性質(zhì)或?qū)A與其他生物材料共同使用，擴大其在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

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Advances in research of applying hyaluronan to stem cell culture

LI Qiang1，GUO Xue-ping1，2，ZHANG Tian-min3
(1．School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2．Shandong Freda Biopharm Co．，Ltd．，Jinan 250101，China;3．Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

R966

A

1005-1678(2012)06-0930-03

2012-03-20

李 強，男，碩士研究生，制藥工程學(xué)專業(yè);郭學(xué)平，男，通信作者，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事微生物與生化藥學(xué)研究，Tel:0531-82685555，E-mail:guoxp@fredabiopharm．com．cn。