何蘭芳 李元廣 丘韶校

慢性支氣管炎是嚴(yán)重危害人民身體健康的常見病和多發(fā)病，吸煙是最為重要的誘發(fā)因素，氣道炎癥持續(xù)進(jìn)展并逐漸出現(xiàn)氣道結(jié)構(gòu)破壞、氣道重塑，進(jìn)而出現(xiàn)不可逆性通氣功能障礙，最終導(dǎo)致呼吸衰竭。慢性支氣管炎中氣道結(jié)構(gòu)重塑原因目前尚不十分清楚。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)原癌基因蛋白產(chǎn)物不但參與細(xì)胞的生長、分化等過程的調(diào)節(jié)，且亦能通過多種途徑參與慢性炎癥的病理變化，其中c-jun作為即刻早期原癌基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及多種蛋白合成中的作用中受到關(guān)注。本研究觀察吸煙誘導(dǎo)的慢性支氣管炎大鼠肺組織中c-jun的表達(dá)與小氣道重塑之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 C-Jun兔多克隆抗體、鼠抗兔二抗為Santa Cruz產(chǎn)品;SABC免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。Masson膠原染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。HPLAS-1000高清晰度彩色病理報告分析儀及計算機(jī)圖象處理系統(tǒng)及相應(yīng)軟件(德國Opten)。

1.2 動物模型的建立、分組及標(biāo)本處理 實(shí)驗(yàn)動物為清潔級SD大鼠，2個月齡雄性大鼠40只，體重(200±20)g，購自中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。大鼠隨機(jī)分為正常對照組、吸煙30 d組(Ⅰ組)、吸煙 60 d組(Ⅱ組)、吸煙 90 d組(Ⅲ組)，每組均為10只。參照許三林等的方法制作被動吸煙裝置［1］。實(shí)驗(yàn)香煙為武漢市售紅雙喜牌香煙(武漢卷煙廠制)，尼古丁含量為每支1 mg，焦油含量每支18 mg。吸煙組放人自制的吸煙箱中，每次點(diǎn)燃2支香煙放入，燃燒10 min，休息5 min后再放入2支香煙，每天吸煙40支，每周吸煙6 d。分別在吸煙30、60、90 d后處死各組大鼠。分離肺組織，左下葉置于4%甲醛固定液中保存，常規(guī)石蠟包埋、切片4 μm，組織學(xué)檢查(HE與Masson染色)及免疫組化備用。

1.3 指標(biāo)觀察

1.3.1 肺細(xì)小支氣管病理及形態(tài)學(xué)測定 石蠟切片做Masson染色，測定直徑在750～1100微米 之間，長徑與短徑之比不小于0.7的膜性細(xì)支氣管的外徑、管壁厚度(中膜肌層)、管壁面積和氣管總面積，然后計算管壁厚度與氣管外徑比值(MT%)，管壁面積與氣管總面積比值(MA%)，并計算出均數(shù)，作為大鼠的肺細(xì)小支氣管氣道重構(gòu)定量指標(biāo)觀察。

1.3.2 C-jun基因表達(dá)蛋白JUN免疫組化染色 采用鏈霉親和素-過氧化氫物酶法(SABC法)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作;用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液和正常羊血清取代一抗作為空白對照與替代對照。光鏡下每張切片隨機(jī)選5個含有完整支氣管橫斷面的區(qū)域，計算陽性細(xì)胞個數(shù)并作分析。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察 HE染色鏡下觀察:對照組氣管、肺泡組織結(jié)構(gòu)正常;Ⅰ、Ⅱ組大鼠肺組織中可見明顯慢性細(xì)支氣管炎，炎癥侵犯細(xì)支氣管全層，炎癥細(xì)胞侵及全層(包括固有膜、中膜肌層和外膜)，炎癥細(xì)胞包括單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞，以單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主，黏膜下腺體增生明顯(圖2);而Ⅲ組大鼠與Ⅰ、Ⅱ組比較，除細(xì)支氣管全層炎癥變化外，可見到小氣道全層炎癥向周圍肺組織擴(kuò)散，細(xì)支氣管中膜肌層平滑肌顯著增生、肥厚，排列紊亂，并有廣泛的肺氣腫形成。

2.2 各組大鼠細(xì)支氣管平滑肌層及膠原厚度的比較 Masson染色:對照組及Ⅰ組大鼠細(xì)支氣管平滑肌層菲薄，Ⅱ、Ⅲ組細(xì)支氣管中膜肌較正常組顯著增生肥厚(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠肺組織JUN表達(dá)的比較 正常對照組大鼠肺內(nèi)幾乎無JUN蛋白陽性染色，Ⅰ組大鼠氣道JUN蛋白表達(dá)較對照組明顯增加(P＜0.05)，胞核棕黃色陽性細(xì)胞主要于氣道上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，Ⅱ、Ⅲ組大鼠JUN蛋白陽性細(xì)胞多分布于氣道平滑肌層及炎性細(xì)胞中(P＜0.05)。

3 討論

慢性支氣管炎小氣道慢性炎癥持續(xù)存在，遷延進(jìn)展，氣道炎癥導(dǎo)致的組織損傷修復(fù)反應(yīng)可出現(xiàn)氣道重構(gòu)，平滑肌細(xì)胞增生及結(jié)締組織沉著，從而使末梢氣道腔內(nèi)呈物理性狹窄，導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性減退。c-jun是禽肉瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒基因ASV17的細(xì)胞內(nèi)同源基因，由 Bohmann于1987年發(fā)現(xiàn)［2］。C-jun原癌基因產(chǎn)物Jun為39 kD蛋白，與原癌基因c-fos產(chǎn)物Fos結(jié)合形成異二聚體AP-1或多聚體型反式因子，經(jīng)由亮氨酸拉鏈與DNA上相應(yīng)基因增強(qiáng)子結(jié)合起正調(diào)控作用。細(xì)胞內(nèi)c-jun借助于其堿性亮氨酸拉鏈和Jun家族的其他成員或Fos家族成員形成同源或異源二聚體，組成 AP-1轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合DNA的TPA元件調(diào)控區(qū)，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，影響著細(xì)胞的增殖與分化等多種病理變化。

本實(shí)驗(yàn)觀察到在Ⅰ組大鼠在被動吸煙1個月后，中小支氣管出現(xiàn)慢性氣道炎癥，隨著吸煙時間的延長，氣道炎癥逐漸加重;JUN蛋白陽性染色細(xì)胞亦出現(xiàn)由少致多的變化，JUN蛋白陽性染色細(xì)胞多分布于氣道上皮細(xì)胞、支氣管平滑肌及全氣道壁的慢性炎癥細(xì)胞中，并呈逐漸增多趨勢。香煙煙霧產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，能激活氣道上皮細(xì)胞中的MAPK信號通路，進(jìn)而增強(qiáng)c-jun活性，激活A(yù)P-1相關(guān)靶基因，產(chǎn)生增殖、分化、炎癥等病理變化［3，4］。Rahman等學(xué)者發(fā)現(xiàn)香煙煙霧引起的氧化自由基可激活脂氧化物酶途徑并調(diào)節(jié)DNA組蛋白結(jié)構(gòu)，可進(jìn)一步激活A(yù)P-1及NF-κb等轉(zhuǎn)錄因子，活化一系列致炎性因子如TNF-α等的表達(dá)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展［5］。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在吸煙者及實(shí)驗(yàn)動物氣道上皮在香煙煙霧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，還可引起NF-κB及AP-1與DNA結(jié)合的明顯增加，明顯增加巨噬細(xì)胞炎性蛋白等炎癥因子的表達(dá)［6］。提示在香煙誘導(dǎo)的慢性支氣管炎中，氧化應(yīng)激對氣道造成的損傷可能通過不同途徑誘導(dǎo)c-jun等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)后，通過調(diào)節(jié)一系列相關(guān)基因的表達(dá)將炎癥反應(yīng)放大，而隨著香煙暴露時間的延長，C-jun表達(dá)明顯增高，炎癥反應(yīng)亦逐漸加重。

本實(shí)驗(yàn)中Ⅰ組大鼠吸煙經(jīng)過香煙煙霧暴露1個月后，JUN蛋白較表達(dá)較對空白照組明顯增高，但支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度與空白組無明顯變化;Ⅱ、Ⅲ組大鼠JUN蛋白表達(dá)較Ⅰ組顯著增高，伴隨支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度較Ⅰ組明顯增加，由此推測原癌基因c-jun的表達(dá)可能在氣道平滑肌增生、基底膜增厚等間質(zhì)組織沉積等病理變化中起促進(jìn)的作用。眾多研究表明多種細(xì)胞外刺激如炎癥、應(yīng)激等均可激活c-Jun/應(yīng)激激活性蛋白激酶(JNK)信號通路，使JUN等核轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，進(jìn)一步轉(zhuǎn)核調(diào)節(jié)基因表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)作用［6，7］。而c-jun基因自身的表達(dá)亦在AP-1的結(jié)合調(diào)節(jié)的靶基因系列中，由此可推測各種刺激信號在激活JUK信號系統(tǒng)活性時，可通過c-jun/AP-1迅速調(diào)整各種蛋白表達(dá)，而其中就包括c-jun以及其他細(xì)胞因子、生長因子等，進(jìn)而刺激平滑肌細(xì)胞的增生。Wen Ning等學(xué)者通過基因表達(dá)序列分析及微點(diǎn)陣分析等方法觀察處于GOLD 0期(COPD高危期)與GOLD 2期(COPD中期)吸煙者肺組織中基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)GOLD 2期患者肺組織中JUK的表達(dá)明顯增高，同時伴隨有結(jié)締組織生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子等生長因子表達(dá)與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成的增加，而GOLD 0期吸煙者小氣道未有此種氣道結(jié)構(gòu)變化，亦無JNK的表達(dá)升高［8］，與本試驗(yàn)觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，即在慢支早期無平滑肌細(xì)胞增殖及氣道結(jié)構(gòu)變化，均提示JUK信號途徑及c-jun均可能在慢支的氣道結(jié)構(gòu)重塑病理過程中發(fā)揮著重要作用，綜上，c-jun作為即刻早反應(yīng)細(xì)胞原癌基因可能參與了慢性支氣管炎慢性炎癥及氣道重塑等病理變化。

［1］ 許三林，吳人亮，陳春蓮，等.上皮鈣粘素在吸煙小鼠呼吸道上皮損傷修復(fù)中表達(dá)的研究.中華結(jié)核和呼吸雜志，1999，22(7):417-419.

［2］ Bohmann D，Bos TJ，Admon A，et al.Human proto-oncogene cjun encodes a DNA binding protein with structural and functional properties of transcription factor AP-1.Science，1987，238(4832)386-392.

［3］ Brooke T.Mossman，Karen M.Lounsbury，Sekhar P.Reddy.Oxidants and Signaling by Mitogen-Activated Protein Kinases in Lung Epithelium.Am J Respir Cell Mol Biol，2006，34:666-669.

［4］ John A Marwick，Paul A Kirkham，Christopher S Stevenson，et al.Cigarette Smoke Alters Chromatin Remodeling and Induces Proinflammatory Genes in Rat Lungs.Am J Respir Cell Mol Biol，2004，31:633-642.

［5］ I.Rahman，I.M.Adcock.Oxidative stress and redox regulation of lung inflammation in COPD.2006，Eur Respir J，28:219-242.

［6］ Rahman I，P S Gilmour，L A Jimenez，et al.Oxidative stress and TNF-α induce histone acetylation and NF-κB/AP-1 activation in alveolar epithelial cells:potential mechanism in gene transcription in lung inflammation. Mol. Cell. Biochem，2002，234/235:239-248.

［7］ Di Stefano，A，G.Caramori，T.Oats，et al.Increased expression of nuclear factor-kappaB in bronchial biopsies from smokers and patients with COPD.Eur Respir J，2002，20:556-563.

［8］ Wen Ning，Janet Lee，Naftali Kaminski，et al.Comprehensive A-nalysis of Gene Expression on GOLD-2 Versus GOLD-0 Smokers Reveals Novel Genes Important in the Pathogenesis of COPD.Proc Am Thorac Soc，2006，3:466.