姜 和，付訓(xùn)忠，閔文杰

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054;2.重慶前沿生物技術(shù)有限公司，重慶 400041)

多肽類藥物的研究與開(kāi)發(fā)是我國(guó)21世紀(jì)生物醫(yī)藥研究的重點(diǎn)方向之一。許多多肽對(duì)人的生理與病理過(guò)程，疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療有著重要意義，在臨床上具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。然而在多肽類藥物的研究與開(kāi)發(fā)中，往往因在下游的分離與純化過(guò)程中所存在的技術(shù)瓶頸，導(dǎo)致難以獲得令人滿意的目標(biāo)多肽或制備規(guī)模。近年來(lái)一類新型的聚合物分離介質(zhì)因其良好的分離效果、穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)及高吸附載量，在多肽類藥物的分離與純化中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，也為多肽的分離介質(zhì)選擇提供了新的途徑。

目前，在多肽分離純化中最常用的分離介質(zhì)是以硅膠為基質(zhì)的反相填料(如 C4、C8、C18等)，然而以C18為代表的反相硅膠填料存在穩(wěn)定性差、pH值使用范圍窄(pH值為2～8)、易污染、難以清洗和再生等缺點(diǎn)，同時(shí)在反相體系中多肽會(huì)帶有電荷，易被硅膠表面所帶的硅醇基吸附，導(dǎo)致出現(xiàn)峰型展寬、拖尾等不利影響［1－2］。此外，一些堿性多肽在酸性條件下不能被分離，而只有在堿性條件下才能夠被分離。為了克服反相硅膠分離介質(zhì)固有的缺陷，學(xué)者們把注意力轉(zhuǎn)向了一類新型的聚合物分離介質(zhì)。此類分離介質(zhì)的pH值使用范圍大(pH值為1～14)，在強(qiáng)酸及強(qiáng)堿溶液體系中化學(xué)穩(wěn)定性和粒徑均一性好。其中在多肽分離中應(yīng)用最多的反相聚合物分離介質(zhì)表面無(wú)極性，不含鍵合的烷基官能團(tuán)和殘留的硅醇基，不易產(chǎn)生不可逆的吸附作用，并且能有效保持生物樣品的活性，可代替反相硅膠應(yīng)用于多肽類物質(zhì)的分離純化［3－4］。此外這些分離介質(zhì)還能抵御極端條件下的在線清洗。在高pH值條件下的反相分離能夠使分離度增加，并且提高堿性樣品的溶解度［5－11］。

1 聚合物分離介質(zhì)的發(fā)展、分類與性能

自20世紀(jì)60年代以來(lái)，聚合物作為色譜介質(zhì)已被用于生物大分子的分離［12］。但受限于聚合技術(shù)等因素，早期的聚合物剛性較差，只能在低壓、低流速下使用，不能用于高效液相色譜分析，且分離能力不佳，難以應(yīng)用于藥物的精細(xì)分離?；瘜W(xué)鍵合相硅膠介質(zhì)(如常用的C18介質(zhì))很好地彌補(bǔ)了聚合物介質(zhì)剛性不足、分離能力有限等缺點(diǎn)，成為廣泛應(yīng)用于多肽的反相高效液相色譜分離介質(zhì)［13－15］，但此類介質(zhì)化學(xué)穩(wěn)定性差，在強(qiáng)酸或堿性環(huán)境中長(zhǎng)期使用會(huì)造成鍵合相脫落或基質(zhì)溶解，嚴(yán)重影響色譜柱的分離效果和使用壽命。與使用范圍限于pH值為2～8的硅膠類介質(zhì)相比，聚合物分離介質(zhì)不僅能耐受低pH值溶液，還能用NaOH溶液清洗和再生，更適用于多肽等生物分子在反相色譜中的分離，因此，近年來(lái)具有高機(jī)械強(qiáng)度、優(yōu)異分離性能及良好化學(xué)穩(wěn)定性的聚合物分離介質(zhì)又重新引起了科研工作者的關(guān)注。

按照聚合基體的不同，聚合物可以分為聚苯乙烯型和甲基丙烯酸型，分別是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯為聚合單體，加入致孔劑聚合而成。早期的聚合物分離介質(zhì)因孔徑較大，稱為大孔吸附樹(shù)脂，其性質(zhì)介于天然吸附劑(活性炭、硅膠和硅藻土)和離子交換劑之間，其吸附特性與天然吸附劑類似，比離子交換劑更容易再生，是吸附性和分子篩性原理相結(jié)合的分離介質(zhì)［16］。根據(jù)其結(jié)構(gòu)表面帶或不帶有不同極性的功能基，可分為非極性、中極性和極性3類［17］。目前大孔吸附樹(shù)脂已廣泛應(yīng)用于中藥提取液及多肽的分離純化。但因大孔吸附樹(shù)脂本身粒徑較大等因素導(dǎo)致其分離能力較低，在物質(zhì)的精細(xì)分離純化中很難達(dá)到所需的純化要求及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái)隨著聚合技術(shù)的發(fā)展，新型的精細(xì)聚合物分離介質(zhì)隨之誕生。精細(xì)聚合物分離介質(zhì)一般是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯為單體聚合而成，其粒徑分布為數(shù)微米至數(shù)十微米，比表面積達(dá)到600 m2/g，具有更好的粒徑分布、更小的平均粒徑和更高的比表面積，因此擁有更好的分離度和更高的吸附載量，加上其優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性，在多肽等生物分子的反相分離純化中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，且制備規(guī)模也越來(lái)越大。

合成聚合物介質(zhì)的方法有種子聚合法、分散聚合法、懸浮聚合法和乳液聚合法等［18］。根據(jù)欲分離的蛋白多肽特性，可以在聚合物的基礎(chǔ)上鍵合所需基團(tuán)制成相應(yīng)的分離介質(zhì)(如離子交換層析介質(zhì))。在分離制備柱的類型上，也可以將制備柱制成顆粒預(yù)裝柱或單體柱。其中單體柱是將聚合單體原地裝入所需柱體內(nèi)，再加入交聯(lián)劑與致孔劑制成結(jié)構(gòu)上的單體柱。相對(duì)于傳統(tǒng)的顆粒預(yù)裝柱，單體柱的使用不常見(jiàn)，但因其具有相對(duì)簡(jiǎn)單的聚合技術(shù)、良好的流體動(dòng)力學(xué)特性及較小的傳質(zhì)阻抗，使其在多肽微量規(guī)模的分離純化中的應(yīng)用較多。

2 聚合物分離介質(zhì)的應(yīng)用

2.1 大孔吸附樹(shù)脂的應(yīng)用

大孔吸附樹(shù)脂是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一類最早應(yīng)用于物質(zhì)分離的有機(jī)高分子聚合物吸附劑，因其良好的選擇性吸附性能，使其早期被廣泛應(yīng)用于工業(yè)脫色、環(huán)境保護(hù)、天然植物中活性成分提取等領(lǐng)域［13］。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，使得大孔吸附樹(shù)脂在生物活性物質(zhì)生產(chǎn)上的應(yīng)用逐漸增多。該樹(shù)脂的優(yōu)點(diǎn)在于在提取酶、氨基酸、蛋白質(zhì)、肽等時(shí)的條件溫和，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，可避免有機(jī)溶劑帶來(lái)的環(huán)保、成本昂貴等問(wèn)題，還可以避免由于加熱、化學(xué)處理過(guò)程而造成生物活性降低。徐世芳等［19］在酪蛋白非磷肽的分離過(guò)程中，篩選了12種大孔吸附樹(shù)脂，發(fā)現(xiàn)其中DA201－C大孔吸附樹(shù)脂可以非常好地吸附酪蛋白非磷肽，去除其中的無(wú)機(jī)鹽，酪蛋白非磷肽的回收率可達(dá)到95%。唐成康等［20］采用D101大孔吸附樹(shù)脂，從山茱萸干果中提取到粗提物，再經(jīng)SP Sepharose和Sephacryl S－300柱層析，得到一種具有抑制α－淀粉酶活性的糖蛋白(CoGP)。但隨著藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高，以及蛋白多肽類藥物自身特殊性，使得大孔吸附樹(shù)脂在蛋白多肽類藥物的分離純化上的應(yīng)用受到了極大的限制。蛋白多肽類藥物的給藥途徑一般為注射給藥，其對(duì)藥品本身的安全性要求很高，而一般的大孔吸附樹(shù)脂在聚合過(guò)程中加入的聚合單體與致孔劑會(huì)產(chǎn)生許多有毒的有機(jī)殘留物，如苯、苯乙烯和二乙烯苯等，即使在后期的樹(shù)脂預(yù)處理過(guò)程中也很難將這些有機(jī)殘留物完全除掉。而這類殘留物大部分屬于一類有毒有機(jī)溶劑，因此極大地限制了其在蛋白多肽類，以及通過(guò)注射給藥的藥物分離純化上的應(yīng)用。但近年來(lái)國(guó)外科研工作者通過(guò)改進(jìn)聚合技術(shù)研發(fā)出吸附力強(qiáng)、殘留低的聚合樹(shù)脂，如Rohm－Hass(羅門哈斯)生產(chǎn)的XAD系列、Organo(三菱化學(xué))生產(chǎn)的HP系列等。這些吸附樹(shù)脂在有機(jī)殘留物的控制中能夠達(dá)到很高的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。其中Rohm－Hass的XAD16系列樹(shù)脂還通過(guò)了美國(guó)FDA認(rèn)證，使得其能夠安全地應(yīng)用于蛋白多肽類藥物的分離純化，也為大孔吸附樹(shù)脂應(yīng)用于注射給藥類藥物的分離純化開(kāi)創(chuàng)了先例。

2.2 精細(xì)聚合物分離樹(shù)脂的應(yīng)用

雖然有機(jī)殘留低的大孔吸附樹(shù)脂的出現(xiàn)，使得其在蛋白多肽類藥物的分離純化上的應(yīng)用有了安全性的保障，但大孔吸附樹(shù)脂的大孔徑致使其分離能力受到限制，難以達(dá)到所需的分離能力，更難以應(yīng)用于蛋白多肽類藥物的精細(xì)分離。直到20世紀(jì)90年代，包括Rohm－Hass的CG與XT系列及Organo的CHP系列等在內(nèi)的精細(xì)分離樹(shù)脂的開(kāi)發(fā)成功，才使得上述局面得以打破。此類精細(xì)分離樹(shù)脂的優(yōu)點(diǎn)在于粒徑更小(分析型的平均粒徑可以達(dá)到4 ～10 μm，制備型為20 ～100 μm)，比表面積大，均一系數(shù)高，剛性強(qiáng)度高，再結(jié)合聚合物本身的化學(xué)穩(wěn)定性高，pH值適用范圍廣，吸附載量高等諸多優(yōu)勢(shì)，使得該類樹(shù)脂近年來(lái)在植物有效成分、多肽、生長(zhǎng)因子、酶、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的分離純化中的應(yīng)用越來(lái)越普遍，也取得了很好的分離效果，且可以放大至制備規(guī)模［21－23］。Jamil Mohammad 等［24］使用粒徑 5 μm 的聚乙烯苯 － 二乙烯基苯聚合物預(yù)裝柱(150 mm ×4.6 mm I.D)，在pH值為2～12的溶液中對(duì)血管緊張素肽混合物進(jìn)行了分離條件研究的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在以乙腈為洗脫液的反相分離條件和pH值為12(10mM/NaOH)的條件下多肽混合物得到了很好的分離，且分離度高于其他酸性溶液。Michiel H.M等［25］利用聚苯乙烯苯－二乙烯基苯聚合單體柱，在LC/MS模式下對(duì)其應(yīng)用于蛋白降解物分析的可能性進(jìn)行了研究。使用不同柱長(zhǎng)的制備柱對(duì)含有9種蛋白混合物的蛋白降解物進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)隨著柱長(zhǎng)的增加，其峰容量明顯增加。Quanzhou Luo 等［26］使用 10 μm 粒徑的聚乙烯苯－二乙烯基苯聚合物制成的多孔開(kāi)管式開(kāi)放柱與強(qiáng)離子交換柱和質(zhì)譜串聯(lián)形成在線三維俘獲柱，應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的超痕量物質(zhì)研究。研究表明，在使用上述三維俘獲柱對(duì)一種宮頸癌細(xì)胞株差異凝膠胰蛋白酶的降解物進(jìn)行分離與分析時(shí)，最終包括癌癥相關(guān)蛋白(如MAP激酶)的5047種多肽的1857種獨(dú)立蛋白被識(shí)別與鑒定。

相對(duì)于聚苯乙烯型分離介質(zhì)，甲基丙烯酸型分離樹(shù)脂的研究起步較早，且多以聚合成的單體柱應(yīng)用于物質(zhì)的分離。從反相分離性能上比較來(lái)看，甲基丙烯酸型反相分離樹(shù)脂的疏水性要低于聚苯乙烯型反相分離樹(shù)脂，其在植物有效成分、酶及蛋白多肽的分離純化上也有很好的應(yīng)用。Lee等［27］使用甲基丙烯酸聚合而成的單體毛細(xì)管柱對(duì)核糖核酸酶A、細(xì)胞色素C、肌紅蛋白、卵清蛋白混合物進(jìn)行分離，在優(yōu)化了的梯度洗脫條件下混合物得到了很好的分離。

我國(guó)在聚合物分離樹(shù)脂上的研究相對(duì)于國(guó)外起步較晚，但近年來(lái)也相繼開(kāi)發(fā)出國(guó)產(chǎn)的聚合物分離樹(shù)脂，并成功應(yīng)用于包括蛋白多肽類在內(nèi)的各種生物大分子的分離純化。邵承偉等［28］采用聚苯乙烯－二乙烯基苯(PS－DVB)型麥科菲反相高效液相色譜柱 (MKF－RP－MH)對(duì)胸腺素 α1(Tα1)進(jìn)行分離，采用乙腈為洗脫液進(jìn)行反相梯度洗脫，在優(yōu)化色譜條件(流動(dòng)相A:0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為7.0或8.0;流動(dòng)相B:乙腈，梯度洗脫條件 0～20 min，0～10%乙腈，20～30 min，10% ～30% 乙腈;溫度:30℃;流速:0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):214 nm)下分離了胸腺素α1標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。樣品濃度在0.05～4.00 g/L時(shí)，線性方程為 C=0.0099A －0.078，r=0.9904，胸腺肽α1最大載量為6 g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:聚合物型MKF－RP－MH反相色譜柱可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的C18硅膠柱，很好地應(yīng)用于Tα1的分離純化。

3 反相聚合物型分離介質(zhì)與反相硅膠(C18)在蛋白多肽分離純化應(yīng)用上的比較

3.1 應(yīng)用于分離純化所存在的優(yōu)勢(shì)

1)化學(xué)穩(wěn)定性高。目前傳統(tǒng)的C18反相硅膠填料是以硅膠為基體，鍵合上疏水基團(tuán)，其pH值適用范圍基本在2～8，pH值偏高或者偏低都會(huì)對(duì)填料本身產(chǎn)生損傷。特別是當(dāng)pH偏高時(shí)硅膠基體會(huì)發(fā)生明顯的溶解。而反相聚合物分離介質(zhì)是以聚合單體為基體，加入交聯(lián)劑聚合而成，沒(méi)有鍵合相，在pH值為1～14的條件下都具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性。因此對(duì)于那些在堿性條件下具有良好分離效果的蛋白多肽混合物，反相聚合物分離樹(shù)脂具有明顯的穩(wěn)定性優(yōu)勢(shì)。

2)吸附載量高。對(duì)于制備規(guī)模的混合物的分離純化，分離介質(zhì)的吸附載量的高低在很大程度上決定著分離純化的效率與成本。相對(duì)于C18反相硅膠，反相聚合物分離介質(zhì)在吸附能力上具有明顯的優(yōu)勢(shì)。如在使用Rohm－Hass的CG系列反相樹(shù)脂對(duì)牛血清蛋白進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)［29］:其有效分離載量基本達(dá)到30 mg/mL，且隨著載樣流速的增加，其有效分離吸附載量沒(méi)有明顯的變化;而 C18反相硅膠的有效分離吸附載量為10 mg/mL，當(dāng)載量繼續(xù)增大時(shí)其分離效果明顯降低。

3)與C18在多肽的分離上具有很好的互補(bǔ)性。精細(xì)聚合物反相分離樹(shù)脂的出現(xiàn)使得聚合物分離填料應(yīng)用于蛋白多肽的分離純化成為現(xiàn)實(shí)。對(duì)于C18反相硅膠填料較難分離的復(fù)雜多肽混合物，精細(xì)樹(shù)脂可能具有更好的選擇性。王靜等［15］以二乙烯基苯為原料，采用微孔膜乳化－懸浮聚合法制備了粒徑為25 μm的聚二乙烯基苯(PDVB)微球，考察了PDVB介質(zhì)的物理性能及其作為半制備級(jí)反相高效色譜填料的分離性能和應(yīng)用潛力，并且對(duì)PDVB微球在多肽分離上的性能進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)以催產(chǎn)素、血管緊張素Ⅱ、血管緊張素Ⅰ和胰島素的混合溶液為樣品，在以TFA作為離子對(duì)試劑的條件下反相梯度洗脫分離，并且與相同粒徑的商品化的C18球形介質(zhì)進(jìn)行了對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:PDVB半制備柱對(duì)4種多肽的混合物能完全分離，各相鄰兩色譜峰的分離度均大于1.5，各峰的拖尾因子均在 1.00 ～1.35，峰形較對(duì)稱，理論塔板數(shù)最高可達(dá)21000 m－1;而C18介質(zhì)分離譜圖峰形較寬，分離度及理論塔板數(shù)均不及PDVB介質(zhì)，尤其是對(duì)于血管緊張素II和血管緊張素I，二者之間僅相差2個(gè)氨基酸殘基，用C18介質(zhì)難以將二者很好分離。PDVB介質(zhì)實(shí)現(xiàn)了對(duì)二者的完全分離，說(shuō)明在血管緊張素等多肽藥物的分離純化領(lǐng)域，PDVB介質(zhì)有著很好的分離效果。

4)填料易于裝填與再生。作為中低壓分離介質(zhì)，反相聚合物分離樹(shù)脂更易于裝填，而不需要像C18反相硅膠裝填時(shí)所需的高壓和特殊裝填設(shè)備，更利于實(shí)驗(yàn)室研究制備規(guī)模的擴(kuò)大和工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2 應(yīng)用于分離純化所存在的缺陷

雖然隨著聚合技術(shù)的發(fā)展，聚合物分離介質(zhì)的剛性有了很大的改善，其耐壓能力也相應(yīng)有了很大的提高，但相對(duì)于包括C18在內(nèi)的反相硅膠填料，其最大耐壓能力仍低很多，因此也導(dǎo)致在裝填時(shí)所允許的最大裝填壓力低很多，最終導(dǎo)致分離能力的下降。即使在相同粒徑的情況下，聚合物分離介質(zhì)也往往難以達(dá)到與反相硅膠相同的分離能力水平。

4 結(jié)束語(yǔ)

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，生物醫(yī)藥技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，各種具有治療作用的蛋白多肽類物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，因此分離純化這項(xiàng)下游技術(shù)在推動(dòng)其產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中顯得尤為重要。聚合物分離介質(zhì)的出現(xiàn)無(wú)疑為蛋白多肽類物質(zhì)分離純化介質(zhì)的選擇提供了一條新途徑。聚合物分離介質(zhì)自身所特有的高化學(xué)穩(wěn)定性、高吸附載量彌補(bǔ)了傳統(tǒng)反相硅膠填料的許多不足。近年來(lái)的研究與應(yīng)用表明:聚合物分離介質(zhì)在蛋白多肽類物質(zhì)分離純化中具有廣泛的應(yīng)用前景，并日益顯示出其獨(dú)特的作用與優(yōu)勢(shì)。相信隨著研究的深入，不斷涌現(xiàn)的各種性能更加優(yōu)良的聚合物分離介質(zhì)必將和其他各種分離介質(zhì)一起推動(dòng)著蛋白多肽類藥物的研發(fā)，為生物醫(yī)藥技術(shù)的進(jìn)步作出貢獻(xiàn)。

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