王彥月，張 艷，秦新月，陳黎燕，曾 春

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.神經(jīng)內(nèi)科、重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.放射科，重慶 400016）

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是多發(fā)性硬化的常用動(dòng)物模型。國(guó)外采用Lewis大鼠［1］、C57BL／6J小鼠［2］等敏感品系制備模型。但在國(guó)內(nèi)，常因以上動(dòng)物或造模試劑價(jià)格昂貴、難以獲得，而選用Wistar大鼠建立EAE模型。Wistar大鼠雖為非敏感品系，但其易獲得，且造模成本相對(duì)低，故在國(guó)內(nèi)運(yùn)用較廣。目前Wistar大鼠制備EAE存在成功率不穩(wěn)定、制備方法不規(guī)范的缺陷［3－6］。本研究旨在探求制備該模型安全而有效的卡介苗濃度及改良注射方法，提高該模型成功率。

1 材料和方法

1.1 材料

豚鼠15只（重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重380－450g。雌性Wistar大鼠108只（第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），6－8周齡，體重160－190g，分為A、B組，A組60只分為A1－A5共5組，用于最佳卡介苗濃度的篩選；B組48只分為改良組、傳統(tǒng)組、對(duì)照組1、對(duì)照組2共4組，用于觀察不同注射方法對(duì)模型成功率的影響，均采用隨機(jī)數(shù)字表法。

羊毛脂、石蠟油（重慶醫(yī)科大學(xué)設(shè)備科）；卡介苗（bacilus calmette-guerin，BCG）和百日咳桿菌（bordetella pertussis vaccine，BPV）（石家莊偉天科學(xué)儀器設(shè)備有限公司）；CD11b／c等價(jià)抗體（Abcam），F(xiàn)ITC標(biāo)記的熒光二抗（武漢博士德），釓噴酸替酸葡甲胺（Gd-DPTA）（廣州先靈）。磁共振（美國(guó)GE，1.5T），倒置相差顯微鏡（日本 Olympus）。

1.2 抗原的制備

羊毛脂和石蠟油按1：3配成不完全福氏佐劑（incomplete Freund＇adjuvant，IFA），消毒備用。臨用前，將BCG加入IFA中，制成含BCG分別為1 mg／ml，5mg／ml，10mg／ml，15mg／ml，20mg／ml的完全福氏佐劑（complete Freund＇adjuvant，CFA）CFA1－CFA5。制備豚鼠全脊髓勻漿（spinal cords homogenate of guinea pig，GPSCH）［5］。將 GPSCH與等量的CFA混勻，冰上抽打成油包水型乳劑即得抗原。

1.3 模型的誘導(dǎo)

四足墊加尾跟部皮下注射抗原，0.5ml／只。四足墊皮下注射分常規(guī)法（足指／趾向足掌方向注射）、改良法（足掌向足指／趾方向注射）。A組均采用改良法，分別以CFA1－CFA5配制的抗原免疫A1－A5組，以篩選出最佳BCG濃度。以含最佳BCG濃度的抗原免疫B組大鼠，改良組及對(duì)照組1采用改良法注射，傳統(tǒng)組及對(duì)照組2以傳統(tǒng)法注射，以觀察不同注射方法對(duì)模型成功率及存活率的影響。對(duì)照組1、2用CFA與等量生理鹽水混合物替代抗原。記免疫當(dāng)天為d0，以后每天依次記為d1，d2，d3－d24。d0雙后足背皮下加注BPV，0.05ml／只。

1.4 臨床評(píng)分

參照常用的5分法［7］，雙盲法兩人進(jìn)行臨床癥狀評(píng)分，取其平均值。評(píng)分≥1為臨床發(fā)病。

1.5 MRI檢查

d12及d16，行常規(guī) MRI檢查，序列包括T1WI、PDWI、T2WI、FLAIR。之后，經(jīng)尾靜脈注射Gd-DPTA（0.20ml／只）行T1WI增強(qiáng)掃描。

1.6 取材及染色

d16時(shí)已發(fā)病大鼠，均在d16行MRI檢查后取材，切片［8］。余觀察至d24時(shí)取材。

HE染色、Luxol Fast blue（LFB）髓鞘染色均按常規(guī)方法進(jìn)行。

小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色：PBS洗2次，2%小牛血清白蛋（BSA）封閉1h，加一抗CD11b／c等價(jià)抗體37℃孵育過(guò)夜，PBS洗2次，加FITC標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h，PBS洗3次。陰性對(duì)照組以PBS緩沖液替代CD11b／c等價(jià)抗體，其他步驟同上。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0，率的比較用卡方檢驗(yàn)；均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同BCG濃度誘導(dǎo)EAE的模型成功率及存活率

通過(guò)觀察A1－A5組（表1），發(fā)現(xiàn)A4組的模型成功率及存活率均較高。將A4組與其余4組進(jìn)行組間比較，A4組的模型成功率較A1組（P＜0.01），A2組（P＜0.01），A3組（P＜0.05），A5組（P＜0.05）高；A4組的存活率較 A5組高（P＜0.05），而與A1－A3無(wú)明顯差異。綜上，A4組模型成功率最高，而存活率也較高。即CFA中BCG濃度為15 mg／ml時(shí)，為誘導(dǎo)EAE的最佳濃度。

表1 不同BCG濃度制備EAE模型的成功率及存活率

對(duì)B組觀察發(fā)現(xiàn)（表2）：在d0-d7，改良組、傳統(tǒng)組、對(duì)照組1、2分別有一只死亡。d8至d12，改良組及傳統(tǒng)組分別有100%、66.7%出現(xiàn)食欲減退、體重下降等表現(xiàn)，但無(wú)典型發(fā)病表現(xiàn)。d12至d16，改良組、傳統(tǒng)組的發(fā)病率分別為91.7%（n＝11）、33.3%（n＝4），改良組發(fā)病率高于傳統(tǒng)組（P＜0.05）；與傳統(tǒng)組相比較，改良組的潛伏期短（P＜0.05），發(fā)病達(dá)高峰時(shí)間快（P＜0.05），最高臨床癥狀評(píng)分的均數(shù)及存活率無(wú)顯著差異。對(duì)照組1、2在d0至d24無(wú)明顯發(fā)病表現(xiàn)。

2.2 MRI掃描及病理學(xué)改變

MRI掃描發(fā)現(xiàn)：d12，臨床評(píng)分≥3的EAE，病變多在腦橋、小腦散在分布，呈斑塊狀，在T2WI中顯示為長(zhǎng)T2高信號(hào)；d16，臨床評(píng)分≥3的EAE，病變多分布于大腦、腦橋，以卵圓形或斑塊狀居多，平掃信號(hào)變化同上；d16臨床評(píng)分＝4的EAE，增強(qiáng)掃描可見(jiàn)大腦白質(zhì)、皮質(zhì)卵圓形不均勻強(qiáng)化灶（圖1）。改良組與傳統(tǒng)組EAE的MRI改變無(wú)明顯差別。對(duì)照組1、2未見(jiàn)明顯異常。受MRI設(shè)備的限制，無(wú)法分辨脊髓病灶。

表2 改良組與傳統(tǒng)組EAE模型的發(fā)病情況比較

病理學(xué)改變：在MRI掃描發(fā)現(xiàn)的病灶部位及脊髓膨大處取材，HE染色可見(jiàn)大量炎性病灶（圖2，A），病灶區(qū)有許多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2，B）；LFB染色可見(jiàn)髓鞘脫失（圖2，C）。小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色，可見(jiàn)EAE病灶部位有大量小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)（圖2，D），對(duì)照組沒(méi)有或僅有少量小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。

圖1 d16，改良組EAE，大腦增強(qiáng)病灶（MRI）

圖2 d16，改良組EAE，脊髓炎性細(xì)胞侵潤(rùn)（A，HE×100；B，HE×400）；脊髓髓鞘脫失（C，LFB×200）；大腦小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)（D，CD11b／c免疫熒光×100）

3 討論

Wistsr大鼠為EAE非敏感品系，其制備模型的發(fā)病率較低，通常報(bào)道［3－6］在50%－72%之間。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選得出誘導(dǎo)EAE的最佳BCG濃度，進(jìn)而改良抗原注射方法，誘導(dǎo)Wistsr大鼠EAE模型，發(fā)病率高，死亡率低，經(jīng)濟(jì)可行，為進(jìn)一步開(kāi)展多發(fā)性硬化的基礎(chǔ)研究提供了方便。

改良方法制備的EAE模型，其HE、Luxol fast blue以及小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果與經(jīng)典EAE［8－12］模型一致。M.Rausch等［9］報(bào)道 Lewis大鼠EAE模型的發(fā)病部位隨時(shí)間推移，由腦干向中腦，再向皮質(zhì)移動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)MRI掃描所觀察到的與其基本一致。這些都充分證實(shí)改良方法制備的EAE模型是成功的。

由于MRI設(shè)備限制，本實(shí)驗(yàn)無(wú)法開(kāi)展脊髓病變部位以及疾病早期的微?。瘽摲≡畹腗RI觀察。而新型造影劑超小超順磁性鐵氧化物（ultra-small superparamagnetic iron oxide，USPIO）［9－11］，可以彌補(bǔ)這一不足，在將來(lái)的研究中值得進(jìn)一步嘗試與探索。

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