劉金龍，鄔淑雁，劉麗紅，于愛軍，張學(xué)軍，孫志德

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 普外一科，河北 承德 067000）

外周血生存素的表達(dá)與胃癌生物學(xué)行為相關(guān)性研究

劉金龍，鄔淑雁，劉麗紅，于愛軍，張學(xué)軍，孫志德

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 普外一科，河北 承德 067000）

目的 以反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－酶聯(lián)免疫測定（RT-PCR-ELISA）方法，檢測胃癌患者外周血中生存素基因的表達(dá)。并分析其與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系，探討其作為評價胃癌生物學(xué)行為及預(yù)后檢驗指標(biāo)的可能性。方法收集53例胃癌患者外周血，以RT-PCR-ELISA方法檢測胃癌患者外周血中生存素mRNA的表達(dá)，比較其是否與腫瘤部位、大小、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期具有相關(guān)性。結(jié)果53例胃癌外周血中60.4%（32例）生存素mRNA表達(dá)陽性。腫瘤＞5cm及≤5cm生存素mRNA表達(dá)率分別為78.3%、46.0%。浸潤深度達(dá)漿膜層者外周血生存素mRNA表達(dá)率74.2%，高于侵及黏膜下層及肌層的表達(dá)率（33.3%），淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者外周血表達(dá)率為75.0%，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)率（29.4%）。結(jié)論生存素mRNA在外周血的表達(dá)與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期均有明顯相關(guān)性，但與腫瘤部位、分化程度無明顯相關(guān)。外周血生存素的表達(dá)可作為評價胃癌生物學(xué)行為及預(yù)后的參考指標(biāo)。

生存素；胃癌；反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；酶聯(lián)免疫測定；外周血

（ChinJLabDiagn，2012，16：0057）

凋亡蛋白抑制因子（inhibitors of apoptosis protein，IAP）是一族凋亡抑制蛋白，生存素（survivin）是新近發(fā)現(xiàn)的IAP家族成員之一，但具有不同于IAP家族其他成員的獨特結(jié)構(gòu)和性質(zhì)［1］。已有研究表明，survivin不僅在多種人類腫瘤中有異常表達(dá)，且與腫瘤預(yù)后不良的病理參數(shù)有關(guān)［2－4］。本研究通過檢測外周血生存素mRNA的表達(dá)，旨在探討生存素的表達(dá)與胃癌生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系。

1 標(biāo)本來源和方法

1.1 標(biāo)本來源

血液標(biāo)本取自2007年6－12月我院外科的53例胃癌手術(shù)患者。術(shù)前均未接受過化療或放療。診斷均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實。其中男30例，女23例；年齡30－75歲，平均62歲；高分化腺癌6例，中分化腺癌13例，低分化腺癌20例，未分化腺癌10例，中分化鱗癌1例，低分化鱗癌2例，中分化類癌1例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者17例。

1.2 取材及試劑

外周血為術(shù)前外周靜脈抽血，置－80℃保存。Survivin信息核糖核酸檢測試劑盒購自四川新創(chuàng)生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 采集1ml靜脈血于抗凝管中，4℃3 000rpm離心10min收集細(xì)胞沉淀，用Trizol試劑提取細(xì)胞沉淀中的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按廠商說明合成cDNA，用特異的熒光素標(biāo)記引物對生存cDNA（來自血液中的游離腫瘤細(xì)胞）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物，即熒光素標(biāo)記的生存素DNA片段。生存素轉(zhuǎn)錄物的PCR擴(kuò)增采用順向引物序列為5′-GGC ATG GGT GCC CGG ACG TT-3′及逆向引物序列為5′-AGA GGC CTC AAT CCA TGG CA-3′。循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，62℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。產(chǎn)物為439bp的部分生存素DNA序列片段。

1.3.2 酶聯(lián)免疫測定 96孔雜交板的包被底物為439bp生存素DNA序列片段中一段338bp片段作為探針。用NaOH變性熒光素標(biāo)記的生存素標(biāo)準(zhǔn)和血樣PCR產(chǎn)物并與包被片斷雜交，50℃保溫2小時，洗去未雜交的核酸，用抗熒光素－HRP結(jié)合物測定雜交的生存素擴(kuò)增產(chǎn)物，顯色反應(yīng)底物TMB，以酶標(biāo)儀讀取A450／630。通過直線回歸比較計算擴(kuò)增的生存素cDNA相對含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用spss13.0統(tǒng)計分析軟件，定性資料以百分率表示，組間差異的分析采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

胃癌外周血中生存素表達(dá)結(jié)果見表1。53例胃癌外周血中60.4%（32例）生存素mRNA表達(dá)陽性。腫瘤＞5cm患者30例，≤5cm患者23例.腫瘤＞5cm生存素mRNA表達(dá)率78.3%，遠(yuǎn)高于腫瘤≤5cm的胃癌患者（46%），P＝0.021，有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 生存素的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

浸潤深度達(dá)漿膜層者外周血生存素mRNA表達(dá)率74.2%，高于侵及黏膜下層及肌層的表達(dá)率（33.3%），P＝0.004，有統(tǒng)計學(xué)意義。淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者外周血表達(dá)率為75.0%，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)率（29.4%），P＝0.002，有統(tǒng)計學(xué)意義。

胃癌低及未分化外周血生存素mRNA表達(dá)率（68.8%）雖高于高中分化表達(dá)率（47.6%），但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。病灶位于賁門、胃體、胃竇表達(dá)率分別為61.5%、66.7%、56.0%，P＝0.671，無統(tǒng)計學(xué)意義。

胃癌外周血中生存素表達(dá)陽性率與胃癌分期之間的關(guān)系見表2。胃癌病理分期按照抗癌國際聯(lián)盟（UICC）TNM方案分期（1997年第五版）。Ⅰ期患者9名，Ⅱ期患者18名，Ⅲ期患者21名，Ⅳ期患者5名。隨病期越晚，外周血中生存素表達(dá)陽性率越高，Ⅰ、Ⅱ期患者表達(dá)率較低，分別為33.3%、38.8%，相差較??；Ⅲ、Ⅳ期表達(dá)率較高，其中Ⅳ 期患者5例均有表達(dá)，陽性率為100%。

表2 生存素的表達(dá)與胃癌臨床病理分期的關(guān)系

綜上所述，生存素mRNA的表達(dá)與胃癌大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病期均具有明顯相關(guān)性（P值均小于0.05），而與胃癌的分化程度及腫瘤的部位無明顯相關(guān)性（P值大于0.05）。

3 討論

生存素（Survivin）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，survivin的高表達(dá)能抑制多種因素如p53、半胱天冬酶（caspase）等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［5］，其在多數(shù)實體腫瘤中存在高表達(dá)，如 Miyachi［6］對107名胃癌病人應(yīng)用實時PCR方法檢測其癌組織和非癌組織中Survivin mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，癌組織中105例有Survivin表達(dá)，且生存素有報道證實并不在血細(xì)胞中表達(dá)［7，8］。所以生存素有可能是具有較高敏感度及特異度的非常理想的外周血中癌細(xì)胞標(biāo)志物。

RT-PCR是目前檢測癌細(xì)胞敏感度較高的一種方法，其在測定血中一種或多種腫瘤標(biāo)志物的信息核糖核酸，以確定血中是否有游離癌細(xì)胞中已得到廣泛應(yīng)用。雖然現(xiàn)今采用的腫瘤標(biāo)志物腫瘤特異性不高，但很多卻具有組織特異性。比如CEA來自上皮細(xì)胞，SCC來自鱗狀細(xì)胞，PSA來自前列腺，AFP來自肝臟。因此如果在血細(xì)胞中檢測到這些腫瘤標(biāo)志物的信息核糖核酸，就表明血細(xì)胞中有來自這些組織或臟器的癌細(xì)胞。這些文獻(xiàn)報道的大多數(shù)都認(rèn)為用反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測血中是否有游離癌細(xì)胞能夠用來進(jìn)行癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的早期診斷，預(yù)后的判斷和治療的監(jiān)測。

本研究中所應(yīng)用的RT-PCR-ELICA檢測方法敏感度較普通RT-PCR不但敏感度更高，有更高的特異性，可重復(fù)性強(qiáng)，且操作簡單［9］。外周血查腫瘤標(biāo)志物提示癌細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移已被證實為一種安全可行的癌癥早期診斷方法。

本研究通過分析外周血生存素的表達(dá)與胃癌主要臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)生存素mRNA在外周血的表達(dá)與腫瘤大小、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，病理分期均有明顯相關(guān)性，但與腫瘤部位、分化程度無明顯相關(guān)，本研究中胃癌低及未分化外周血生存素mRNA表達(dá)率雖高于高中分化表達(dá)率，但無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與本研究樣本量較小有關(guān)。

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Expression of Survivin in the Peripheral Blood of Patients with Gastric Cancer and Its Relationship with Biological Behav- iors of Gastric Cancer

LIUJin-long，WUShu-yan，LIULi-hong，etal.（Dept.ofGeneralSurgery1，TheAffiliated HospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China）

ObjectiveReverse transcriptase polymerase chain reaction and enzyme-linked immuneoassay（RT-PCRELISA）was used to assess the expression of survivin mRNA in the peripheral blood of patients with gastric cancer.We investigated it’s relationship with biological behaviors of gastric cancer to discuss the possibility of being a method to evaluate the prognosis of gastric cancer.Methodsthe peripheral blood was collected from 53patients with gastric cancer.RT-PCR-ELISA was used to assess the expression of survivin mRNA in the peripheral blood of patients with gastric cancer.Calculate the dependability between the expression and the sites，size，infiltration，degree of tumor differentiation，lymph node metastasis and clinical stages.ResultsThe expression rate of survivin mRNA in the peripheral blood of the 53cases of patients with gastric cancer is 60.4%（32cases）.The expression rate for the tumor size＞5cm and≤5cm is according to 78.3%、46.0%。The expression rate of patients whose plasma membrane were infiltrated is 74.2%，which is higher than others（33.3%）.when there was lymph node metastasis，the expression rate is 75.0%，which is higher than the rate when there was no lymph node metastasis（29.4%）.ConclusionThe expression of survivin in the peripheral blood was related with the size，infiltration，lymph node metastasis and clinical stages，but was not correlated with sites or the degree of tumor differentiation.The expression of survivin in the peripheral blood might be a referenced indicator in evaluating the biological behaviors and prognosis of gastric cancer.

Survivin；Gastric cancer；Reverse transcriptase polymerase chain reaction；Enzyme-linked immunoassay；Peripheral blood

R735.2

A

1007－4287（2012）01－0057－03

2010－12－25）