劉 蕾， 徐 進(jìn)， 許景升， 陳匡宇， 張麗勍， 張 昊， 馮 潔

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

青枯菌Po82菌株Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)控基因hrpB的功能研究

劉 蕾， 徐 進(jìn)， 許景升， 陳匡宇， 張麗勍， 張 昊， 馮 潔＊

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

本文以青枯菌致病力分化菌株P(guān)o82的Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)控基因hrpB為研究對(duì)象，采用同源重組雙交換法，構(gòu)建獲得青枯菌Po82菌株的hrpB基因缺失突變株P(guān)o82ΔhrpB及其互補(bǔ)菌株P(guān)o82ΔhrpB－pML123－h(huán)rpB，并對(duì)野生型菌株、突變株和互補(bǔ)菌株進(jìn)行了致病力及生物學(xué)功能的驗(yàn)證。致病力測(cè)定結(jié)果表明，青枯菌hrpB基因缺失突變株P(guān)o82ΔhrpB的致病力較Po82野生型菌株顯著下降，而互補(bǔ)菌株P(guān)o82ΔhrpB－pML123－h(huán)rpB能夠部分恢復(fù)突變菌株的致病力。生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明，在營(yíng)養(yǎng)貧瘠型培養(yǎng)基中，hrpB基因缺失突變株P(guān)o82ΔhrpB的生長(zhǎng)速率較野生型青枯菌Po82菌株快，但是在營(yíng)養(yǎng)豐富型培養(yǎng)基中，兩者生長(zhǎng)速率基本一致。野生型和突變株的運(yùn)動(dòng)性測(cè)定結(jié)果顯示，兩者的運(yùn)動(dòng)性無(wú)顯著差異。表明hrpB基因在青枯菌致病過(guò)程中具有重要影響，并對(duì)進(jìn)一步發(fā)掘鑒定Po82菌株中新的Ⅲ型效應(yīng)子，進(jìn)而深入解析其致病力分化的分子機(jī)理具有重要的作用。

青枯菌； Ⅲ型分泌系統(tǒng)；hrpB基因； 致病性

茄科雷爾氏菌［Ralstoniasolanacearum（Smith） Yabuuchi et al.］，簡(jiǎn)稱青枯菌，是一種地域分布廣且寄主范圍非常大的毀滅性植物病原細(xì)菌［1］。進(jìn)入寄主植物根部后，青枯菌侵入木質(zhì)部導(dǎo)管，隨后通過(guò)維管束系統(tǒng)快速擴(kuò)展至植物的地上部分。青枯病典型的快速萎蔫癥狀是由病原菌在維管束中產(chǎn)生大量胞外多糖從而阻塞水分運(yùn)輸所致。青枯菌作為研究寄主植物與病原細(xì)菌分子互作的模式系統(tǒng)之一，目前通過(guò)分子遺傳學(xué)的研究手段已經(jīng)鑒定出了多個(gè)與致病相關(guān)的基因［2－3］。與其他革蘭氏陰性菌相同，Ⅲ型分泌系統(tǒng)（typeⅢsecretion system，T3SS）在青枯菌致病過(guò)程中起重要作用。Ⅲ型分泌系統(tǒng)通過(guò)高度保守的裝置將蛋白分泌至細(xì)胞外，并且通過(guò)可變的胞外裝置將效應(yīng)子蛋白輸送至植物細(xì)胞內(nèi)，干擾宿主細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為病原菌在細(xì)胞內(nèi)存活創(chuàng)造有利條件［4－5］。試驗(yàn)證明，Ⅲ型分泌系統(tǒng)缺失突變株無(wú)法引起寄主的病害特征［6－7］。

青枯菌菌體細(xì)胞與植物細(xì)胞物理接觸后，感知來(lái)自寄主植物的信號(hào)，繼而啟動(dòng)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)控制Ⅲ型分泌系統(tǒng)及其效應(yīng)子編碼基因的表達(dá)。近年來(lái)，針對(duì)植物信號(hào)所調(diào)控的hrp（hypersensitive response and pathogenicity）基因簇的研究［8－9］明確了細(xì)菌的胞外受體蛋白PrhA（plant regulator of hrp gene）接收植物細(xì)胞信號(hào)，并將信號(hào)依次轉(zhuǎn)導(dǎo)并激活調(diào)控基因prhJ、prhJ和hrpG基因的表達(dá)，并最終調(diào)控hrpB基因的表達(dá)。其中，PrhA、PrhJ、HrpG是植物信號(hào)的中間遞體，信號(hào)的最終受體是hrpB基因［10］。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（minimal medium）中或者與植物細(xì)胞共培養(yǎng)，hrp基因簇的表達(dá)依賴于轉(zhuǎn)錄 激 活 因 子 HrpB［9，11］。HrpB 調(diào) 控 因 子 屬 于AraC家族，位于青枯菌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的最下游。它不僅激發(fā)hrp基因簇中各轉(zhuǎn)錄單元及其上游popABC操縱子的表達(dá)，同時(shí)還調(diào)控了其他多個(gè)基因的表達(dá)，其中包括許多依賴T3SS分泌系統(tǒng)釋放的效應(yīng)蛋白。作為調(diào)控因子，HrpB的作用原理是通過(guò)與Ⅲ型分泌系統(tǒng)裝置蛋白及效應(yīng)蛋白編碼基因上游的hrpII框（TTCGN16TTCG）順式作用元件結(jié)合，從而啟動(dòng)這些基因的表達(dá)［6］。近年來(lái)，對(duì)于hrpB突變株的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，HrpB調(diào)控因子不僅控制Ⅲ型分泌系統(tǒng)組成基因以及超過(guò)60種的效應(yīng)子基因的表達(dá)，而且控制依賴于Ⅲ分泌系統(tǒng)輸出途徑相關(guān)基因的表達(dá)［5］。因此，調(diào)控因子HrpB參與青枯菌侵染植物過(guò)程，并且對(duì)青枯菌的致病性有重要影響。

茄科雷爾氏菌是一個(gè)高度復(fù)雜的種群。2009年，本實(shí)驗(yàn)室依照國(guó)際新近提出的演化型分類框架對(duì)保存的286株青枯菌進(jìn)行了遺傳多樣性的研究［12－13］。并從中發(fā)現(xiàn)一株編號(hào)為Po82的菌株，該菌株的演化型分類歸屬為演化型Ⅱ／序列變種4，不僅可以對(duì)番茄、馬鈴薯、茄子等茄科植物致病，而且同時(shí)又對(duì)香蕉致病。Po82菌株具有NPB菌株（no pathogenic to banana）和傳統(tǒng)香蕉菌株的致病特征，因此，Po82菌株是一株珍貴的致病力分化菌株［14－15］。

本試驗(yàn)以青枯菌致病力分化菌株P(guān)o82為研究對(duì)象，采用同源重組雙交換的方法，使用慶大霉素抗性基因?qū)Β笮头置谙到y(tǒng)調(diào)控基因hrpB進(jìn)行了替換。獲得了青枯菌菌株P(guān)o82的hrpB基因突變株，命名為Po82ΔhrpB。通過(guò)致病力測(cè)定以及相關(guān)生物學(xué)研究，明確了Po82ΔhrpB的生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究青枯菌株P(guān)o82的Ⅲ型分泌系統(tǒng)及發(fā)掘新的Ⅲ型效應(yīng)子奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

本研究所使用的菌株、質(zhì)粒特征及來(lái)源見(jiàn)表1。青枯菌株P(guān)o82采用NA培養(yǎng)基，28℃條件下培養(yǎng)24～48h。大腸桿菌DH5α采用LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12～16h。

表1 試驗(yàn)中所使用的菌株和質(zhì)粒的來(lái)源及特征

1.1.2 培養(yǎng)基

突變株篩選培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基附加蔗糖貯存液至終濃度10%?？股厥褂媒K濃度為：氨芐青霉素（Amp）：100μg／mL；卡那霉素（Kan）：50μg／mL；慶大

霉素（Gm）：50μg／mL?；A(chǔ)培養(yǎng)基（minimal medium）：Boucher培養(yǎng)基［18］中加入谷氨酸至終濃度20 mmol／L；半固體培養(yǎng)基（SMM）：葡萄糖100mg，蛋白胨100mg，乙二胺四乙酸二鈉38mg，pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液10mL，瓊脂3.5g，用蒸餾水定容到1 000mL，不調(diào)酸度，121℃15min滅菌。

1.1.3 主要試劑

Taq酶，dNTP，GC bufferⅠ／Ⅱ，限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，T－載體等均購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）公司；DNA ladder，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒等均購(gòu)自北京天根生物工程公司；氨芐青霉素（Amp），卡那霉素（Kan），慶大霉素（Gm），IPTG，X－gal為Sigma公司產(chǎn)品；引物和測(cè)序均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 青枯菌Po82菌株hrpB基因缺失突變株的構(gòu)建

青枯菌菌株P(guān)o82基因組DNA的提取步驟參見(jiàn)北京天根生物工程公司說(shuō)明書。突變菌株構(gòu)建采用同源置換法，以慶大霉素抗性基因作為突變體篩選的抗性基因。將hrpB基因上游（UP）和下游（DOWN）各500bp左右片段，以及慶大霉素抗性基因 （gm），按 照 UP－gm－DOWN 的 順 序 構(gòu) 建 至pk18mobsacB載體中，進(jìn)行重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建。根據(jù)NCBI中已發(fā)表的Po82的全基因組序列，分別提取hrpB基因上下游各500bp左右的序列，并設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò) 增 引 物：HrpB－UP（forward）：CCG GAATTC CGCGGCGATCAGAACACG（下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)）；HrpB－UP（reverse）：CGC GGATCC GGCAATGCTC CTGAAGC（下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)）；HrpB－DOWN（forward）：TGC TCTAGA GCCTCTCCAGCGGACCG（下劃線部分為XbaI酶切位點(diǎn)）；HrpB－DOWN（reverse）：CCC AAGCTT AGGTCGCGCA CCAGCTCGACC（下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。慶大霉素抗性基因：GMF：CGC GGATCC GGACGCACACCGTGGAAA（下劃線部 分 為BamH I酶 切 位 點(diǎn)）；GM－R：TGC TCTAGA GGCGGCGTTGTGACAATTT（下劃線部分為XbaI酶切位點(diǎn)）。PCR擴(kuò)增條件：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃7min。構(gòu)建好的重組自殺質(zhì)粒（pk18－h(huán)r－pB－gm）交由上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。

青枯菌感受態(tài)細(xì)胞的制備以及電擊轉(zhuǎn)化參照Ausubel等［19］以及 Laiva［20］等方法。將構(gòu)建好的重組自殺質(zhì)粒pk18－h(huán)rpB－gm電擊導(dǎo)入青枯菌Po82菌株中，經(jīng)過(guò)3次篩選［21］及PCR驗(yàn)證，最終獲得抗慶大霉素和蔗糖，并且對(duì)卡那霉素敏感的hrpB基因突變株P(guān)o82ΔhrpB。

挑取對(duì)卡那霉素敏感的菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。PCR 引 物：HrpB－UP （forward）／ HrpBDOWN（reverse），以及根據(jù)hrpB基因ORF中間序列設(shè)計(jì)引物：BORF－F：ATCCGCCATTCGGATGACC；BORF－R：ACGACTTCCACCTTGGTCTG。PCR擴(kuò)增條件：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃7min。

1.2.2 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建

根據(jù)已發(fā)表的hrpB基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增hrpB基因的ORF序列，經(jīng)酶切連接至互補(bǔ)載體pML123中。hrpB基因引物序列為，BF：GC GGATCC ATGCTGGGAAACATCTACTTCG（下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)）；BR：CCC AAGCTT TCAGCGCCAG ATGGTTTCGG AGG（下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。根據(jù)載體pML123序列設(shè)計(jì)引物PR：AGCCGAATAGCCTCTCCACCC，與BF進(jìn)行PCR驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增條件：變性94℃5min；30個(gè)循環(huán)（94℃30s，58℃30s，72℃1min）；延伸72℃7min。構(gòu)建好的互補(bǔ)載體（pML123－h(huán)rpB）交由上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。

制備青枯菌Po82菌株電擊感受態(tài)，將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pML123－h(huán)rpB電擊導(dǎo)入青枯菌Po82ΔhrpB菌株中，在含有卡那霉素和慶大霉素的平板上進(jìn)行篩選，最終獲得具有抗性的互補(bǔ)菌株P(guān)o82ΔhrpB－pML123－h(huán)rpB。

1.2.3 野生型、突變菌株以及互補(bǔ)菌株致病力測(cè)定

參照He等［22］傷根接種法，接種番茄感病品種‘中蔬5號(hào)’。野生型、突變株以及互補(bǔ)菌株各接種10株，重復(fù)3次。接種后的番茄植株置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：16h光周期，（32±1）℃／（28±1）℃，相對(duì)濕度90%。每天調(diào)查發(fā)病情況，持續(xù)觀察2～3周，記錄病情指數(shù)。青枯病的病情分級(jí)及調(diào)查方法參照 Meng等［23］的方法。用SAS統(tǒng)計(jì)軟件中LSD（p＝0.05）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 突變菌株以及野生型菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

挑取Po82野生型及hrpB基因突變株P(guān)o82ΔhrpB單菌落于NA液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集菌體。生長(zhǎng)曲線的測(cè)定參照 Kanda等［24］方法：（1）以基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基懸浮菌體，調(diào)節(jié)A600至相同大?。s為0.005），28℃，200r／min振蕩培養(yǎng)，間隔6h測(cè)量A600的值，試驗(yàn)共重復(fù)3次。（2）以NA液體培養(yǎng)基懸浮菌體，調(diào)節(jié)A600至相同大小（約為0.005），28℃，200r／min振蕩培養(yǎng)，間隔6h測(cè)量A600的值，試驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.2.5 突變菌株以及野生型菌株運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)參照Kelman等方法［25］。各取5μL濃度為3×108cfu／mL的野生型和突變株的菌體懸浮液，滴加至半固體SMM平板上，28℃條件下培養(yǎng)3～5d。觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性情況，并使用直尺進(jìn)行測(cè)量。

2 結(jié)果

2.1青枯菌Po82菌株hrpB基因缺失突變株的構(gòu)建

本試驗(yàn)中，使用慶大霉素抗性基因作為突變體篩選的抗性基因。將基因上游（UP）和下游（DOWN）各500bp左右片段，以及慶大霉素抗性基因（gm，長(zhǎng)度為855bp），按照 UP－gm－DOWN 的順序構(gòu)建至pk18mobsacB載體中，構(gòu)建hrpB基因重組自殺質(zhì)粒（pK18－h(huán)rpB－gm）。提取質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和HindⅢ進(jìn)行酶切以及測(cè)序驗(yàn)證。酶切結(jié)果如圖1所示表明，泳道1中有2條帶，分別位于6.0kb左右和1.8kb左右。其中，空載pk18mobsacB 長(zhǎng) 度 約 為 5.6kb，片 段 UP－gm－DOWN長(zhǎng)度為1.8kb左右。因此，片段 UP－gm－DOWN已成功連接至pk18mobsacB。

圖1 hrpB基因重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2 青枯菌菌株P(guān)o82突變株的篩選與鑒定

將hrpB基因重組自殺質(zhì)粒（pK18－h(huán)rpB－gm）電擊轉(zhuǎn)化至青枯菌菌株P(guān)o82中，經(jīng)3步篩選，獲得hrpB基因突變株P(guān)o82ΔhrpB。使用PCR方法，對(duì)突變株進(jìn)行鑒定。分別以野生型菌株P(guān)o82的全基因組DNA，hrpB基因重組自殺質(zhì)粒，以及hrpB基因突變株的全基因組DNA為模板，使用引物為HrpB－UP（forward）／HrpB－DOWN（reverse），以 及hrpB基因部分 ORF序列引物BORF－F／BORF－R。PCR鑒定結(jié)果如圖2所示。從PCR結(jié)果可以看出，使用 引 物 HrpB－UP（forward）／HrpB－DOWN（reverse）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，野生型菌株片段長(zhǎng)度為2.4kb左右（圖2，泳道3基因上游及下游序列各500bp，hrpB基因 ORF長(zhǎng)度為1.4kb），hrpB基因重組自殺質(zhì)粒和hrpB基因突變株擴(kuò)增片段為1.8kb（圖2，泳道1，2）；使用引物BORF－F／BORFR進(jìn)行擴(kuò)增，野生型菌株擴(kuò)增出約為600bp的片段（圖2，泳道6），而重組自殺質(zhì)粒（圖2，泳道5）和hrpB基因突變株未能擴(kuò)增出片段（圖2，泳道4）。

圖2 hrpB基因突變株篩選結(jié)果

2.3 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)青枯菌Po82菌株hrpB基因的ORF序列設(shè)計(jì)引物，并連接至互補(bǔ)載體pML123中，構(gòu)建載體pML123－h(huán)rpB。使用引物BF／PR進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增所獲得的片段長(zhǎng)度約為1.6kb。結(jié)果表明，hrpB基因已成功連接至載體pML123中。隨后，將載體pML123－h(huán)rpB電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入突變株P(guān)o82△hrpB中，于含有慶大霉素和卡那霉素的NA平板篩選轉(zhuǎn)化子。用引物BF／PR進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證，最后，將得到的互補(bǔ)菌株命名為Po82ΔhrpB－pML123－h(huán)rpB（圖3）。

圖3互補(bǔ)菌株篩選結(jié)果

2.4 致病力測(cè)定

傷根澆注菌液接種法接種番茄進(jìn)行致病力測(cè)定，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，Po82野生型菌株接種后的番茄植株，于第5天開(kāi)始發(fā)病，而突變株接種后植株則在第6天開(kāi)始表現(xiàn)出明顯萎蔫癥狀；接種后10d，接種野生型菌株植株的病情指數(shù)已高達(dá)3.73，而hrpB基因突變株P(guān)o82ΔhrpB僅為1.63，較野生型菌株降低了56.3%，SAS方差分析結(jié)果表明兩者差異達(dá)極顯著水平（圖4、圖5）。與野生型菌株相比，互補(bǔ)菌株P(guān)o82ΔhrpB－pML123－h(huán)rpB能夠部分恢復(fù)突變菌株的致病力。

圖4 野生型、突變株和互補(bǔ)株接種番茄第10天發(fā)病情況

2.5 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

分別對(duì)青枯菌Po82野生型菌株和hrpB基因突變株P(guān)o82ΔhrpB在營(yíng)養(yǎng)豐富型培養(yǎng)基（NA液體培養(yǎng)基）和營(yíng)養(yǎng)貧瘠型培養(yǎng)基（Boucher基礎(chǔ)培養(yǎng)基）中的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定。圖6結(jié)果表明，青枯菌Po82野生型菌株和突變株P(guān)o82ΔhrpB在營(yíng)養(yǎng)豐富型培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異；方差分析結(jié)果表明，在營(yíng)養(yǎng)貧瘠型培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h后，兩者生長(zhǎng)速率開(kāi)始表現(xiàn)出明顯差異（p＜0.05），Po82ΔhrpB比野生型菌株生長(zhǎng)速率要快。（圖7）。

2.6 運(yùn)動(dòng)性測(cè)定

使用半固體培養(yǎng)基，研究青枯菌株P(guān)o82野生型菌株和hrpB基因突變株P(guān)o82ΔhrpB運(yùn)動(dòng)性。通過(guò)測(cè)量菌落直徑，青枯菌株P(guān)o82野生型菌株和hrpB基因突變株P(guān)o82ΔhrpB的運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有差異（圖8）。結(jié)果表明，hrpB基因的突變對(duì)青枯菌Po82菌株的運(yùn)動(dòng)性沒(méi)有影響。

圖8 野生型菌株P(guān)o82與hrpB基因突變

3 結(jié)論與討論

作為世界范圍內(nèi)最為重要的細(xì)菌病害之一，青枯病受到了各國(guó)植物病理學(xué)家的廣泛關(guān)注。近年來(lái)隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化進(jìn)程的加快，外來(lái)有害生物入侵日益成為各國(guó)關(guān)注的熱點(diǎn)。其中，作為有害外來(lái)生物，香蕉細(xì)菌性枯萎?。ㄇ牙谞柺暇?號(hào)小種）的高風(fēng)險(xiǎn)入侵途徑主要為帶菌植物材料，并且該病菌在我國(guó)屬于具有潛在入侵風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)性外來(lái)有害生物，被列為我國(guó)的檢疫對(duì)象［26］。本實(shí)驗(yàn)室保存的青枯菌Po82菌株由于其寄主范圍的特殊性，本研究將其列為研究對(duì)象，對(duì)于深入解析青枯菌致病力進(jìn)化的分子機(jī)理具有重要意義。

T3SS作為植物病原細(xì)菌分泌毒力因子的重要裝置，已成為植物病理學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一［27］。hrpB起著轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，不僅激發(fā)本基因簇中各轉(zhuǎn)錄單元及popABC操縱子的表達(dá)，同時(shí)調(diào)控了菌體中其他基因的表達(dá)，其中許多為依賴T3SS分泌系統(tǒng)釋放的效應(yīng)蛋白。近年來(lái)，針對(duì)hrpB基因的研究已于多個(gè)青枯菌株中展開(kāi)。Vasse等［28］對(duì)青枯菌1號(hào)小種菌株GMI1000中的hrpB基因功能進(jìn)行研究，結(jié)果表明，hrpB突變株在番茄根部維管束系統(tǒng)中的侵染、定殖和擴(kuò)展能力都有所減弱。Kanda等［24］對(duì)煙草青枯菌OE1－1的hrpB基因進(jìn)行突變，獲得與之類似的結(jié)果。本試驗(yàn)利用同源基因置換法構(gòu)建了青枯菌致病力分化菌株P(guān)o82的hrpB基因突變株P(guān)o82ΔhrpB，并對(duì)該突變株的致病力及生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。研究結(jié)果表明，hrpB基因突變株P(guān)o82ΔhrpB相對(duì)于野生型菌株P(guān)o82，致病力明顯下降，而互補(bǔ)菌株P(guān)o82ΔhrpB－pML123－h(huán)rpB能夠部分恢復(fù)突變株菌株的致病力。綜上所述，hrpB基因?qū)τ谇嗫菥鶳o82菌株的致病性起關(guān)鍵作用。

Kanda等［24］對(duì)煙草青枯菌 OE1－1的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，無(wú)論是在營(yíng)養(yǎng)豐富型培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)貧瘠型培養(yǎng)基中，野生型菌株OE1－1與hrpB基因突變株的生長(zhǎng)速率均保持一致。本試驗(yàn)對(duì)青枯菌Po82菌株的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在營(yíng)養(yǎng)豐富型培養(yǎng)基中，野生型青枯菌Po82菌株的生長(zhǎng)速率與hrpB基因突變株P(guān)o82ΔhrpB基本一致；而在營(yíng)養(yǎng)貧瘠型培養(yǎng)基中，hrpB基因突變株P(guān)o82ΔhrpB的生長(zhǎng)速率比野生型青枯菌Po82菌株快，這與Kanda等［24］研究結(jié)果不一致，而出現(xiàn)這種生長(zhǎng)速率的差異尚未見(jiàn)報(bào)道，目前，還不清楚hrpB基因突變后青枯菌Po82菌株的代謝是否發(fā)生變化，因此，需進(jìn)行下一步試驗(yàn)來(lái)探究其出現(xiàn)差異的原因。

在自然條件下，青枯菌的侵染過(guò)程包括識(shí)別、吸附、侵入、定殖、擴(kuò)展和顯癥等步驟。傷根澆注菌液的接種方法包括以上全部過(guò)程被認(rèn)為最接近于青枯菌自然發(fā)病情況；而莖部注射接種方法缺少識(shí)別、吸附、侵入過(guò)程，僅存在病原菌侵入以后的定殖、擴(kuò)張及顯癥步驟。因此，運(yùn)動(dòng)性在青枯菌侵染初期具有重要的作用，而對(duì)于青枯菌侵入植物以后的致病過(guò)程不起作用。Vasse等［28］研究結(jié)果表明，青枯菌GMI1000菌株hrpB基因缺失突變株在侵染植物過(guò)程中的侵入、定殖和擴(kuò)展的能力有所下降，而識(shí)別和吸附的過(guò)程與野生型沒(méi)有差異。本試驗(yàn)對(duì)于野生型菌株和突變菌株的運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)表明，hrpB基因?qū)η嗫菥鶳o82菌株的運(yùn)動(dòng)性沒(méi)有影響，與上述結(jié)論相一致。

hrpB基因不僅激發(fā)hrp基因簇中參與形成Ⅲ型分泌系統(tǒng)裝置蛋白編碼基因的表達(dá)，同時(shí)正調(diào)控依賴T3SS分泌系統(tǒng)泌出的效應(yīng)蛋白，因此，在鑒定新的Ⅲ型效應(yīng)子過(guò)程中，hrpB基因突變株的構(gòu)建是至關(guān)重要的步驟。Cunnac等［29］在構(gòu)建了青枯菌GMI1000菌株的hrpB基因突變株的基礎(chǔ)上，鑒定出了48個(gè)新的依賴于hrpB基因的Ⅲ型效應(yīng)子。因此，青枯菌Po82菌株hrpB基因缺失突變株的構(gòu)建及其相關(guān)生物學(xué)功能的分析對(duì)進(jìn)一步發(fā)掘鑒定Po82菌株中新的Ⅲ型效應(yīng)子，進(jìn)而深入解析其致病力進(jìn)化的分子機(jī)理具有重要的作用。

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The role of typeⅢsecretion system regulatorhrpBgene inRalstoniasolanacearumstrain Po82

Liu Lei， Xu Jin， Xu Jingsheng， Chen Kuangyu， Zhang Liqing， Zhang Hao， Feng Jie
（StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseaseandInsectPests，InstituteofPlantProtection，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China）

Ralstoniasolanacearumstrain Po82，apathogenic variation strain，possesses pathogenic traits of both NPB andMokostrains.hrpBgene encodes a positive regulator and controls the expression of the typeⅢsecretion system （T3SS）and pathogenicity effectors transiting through this pathway.The mutant ofhrpBgene was constructed by using homologous recombination，and named Po82ΔhrpB.Based on the mutant strain，the complement strain was also constructed.The pathogenicity and the biological function of the wild type，the mutant strain and the complement strain were tested.Pathogenicity test showed that disease index of the mutant Po82ΔhrpBwas decreased compared with that of the wild type Po82.Growth curve analysis indicated that Po82ΔhrpBmutant grew as fast as the Po82strain in rich medium，whereas，in Boucher’s minimal medium，Po82ΔhrpBmutant grew faster than the Po82.There were no significant differences between the mutants and wild type strain in the ability of mobility.ThehrpBgene was a critical factor in pathogenicity ofR.solanacearumand played an important role in identifying new typeⅢeffectors and analyzing the molecular mechanism of pathogenicity variation.

Ralstoniasolanacearum； typeⅢsecretion system；hrpBgene； pathogenicity

Q 753

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.002

2011－12－14

2012－01－18

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”）項(xiàng)目（2009CB119200）；國(guó)家高技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃（“863”）項(xiàng)目（2012AA101501）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31101409，31272008）

＊ 通信作者E－mail：jfeng＠ippcaas.cn