吳 狄，王 坤，鄧 祥，黃小梅

（四川文理學(xué)院 化學(xué)與化學(xué)工程系 四川省特色植物開發(fā)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 達(dá)州 635000）

1 引言

隨著人們對(duì)環(huán)境的逐漸重視，環(huán)境中重金屬離子的檢測(cè)備受關(guān)注，比如對(duì)環(huán)境中汞離子（Hg2＋）檢測(cè)的報(bào)道越來(lái)越多，既有熒光法［1］，又有電化學(xué)檢測(cè)法［2］，檢測(cè)原理有：基于Hg2＋對(duì)熒光納米材料的熒光猝滅進(jìn)行Hg2＋的定量檢測(cè)［3］；基于金納米納米顆粒的可視化對(duì)Hg2＋進(jìn)行定量檢測(cè)［4］。Hg2＋能與核酸中的胸腺嘧啶（T堿基）形成T－Hg－T復(fù)合物，其穩(wěn)定性比正常的Watson－Crick堿基對(duì)還要穩(wěn)定［1～2，4～5］，基于這種 THg－T復(fù)合物進(jìn)行 Hg2＋定量檢測(cè)。近年來(lái)，變換DNA的序列設(shè)計(jì)基于富含T堿基的DNA序列實(shí)現(xiàn)快速靈敏地對(duì)Hg2＋的檢測(cè)已經(jīng)研究得非?；馃?，因?yàn)镠g2＋能夠形成T－Hg2＋－T復(fù)合物已通過(guò)電噴霧質(zhì)譜證實(shí)，而其地的金屬離子如Cu2＋不能發(fā)生類似作用，具有高度的特異性和選擇性。

目前碳納米材料逐漸成為了研究熱點(diǎn)材料。碳納米管是一種重要的碳納米材料，它能有效地猝滅熒光染料（如TAMRA）的熒光［6］。，通過(guò)設(shè)計(jì)熒光染料標(biāo)記的DNA序列實(shí)現(xiàn)熒光法檢測(cè)Hg2＋的方法，干擾小，比較利于復(fù)雜樣品中Hg2＋的檢測(cè)。此外，酸處理后的碳納米管（CNTs）富含羧基化帶負(fù)電，單鏈DNA（ssDNA）分子可以靜電和堿基堆積作用很好地纏繞在CNTs表面；而雙鏈DNA（dsDNA）由于本身的剛性結(jié)構(gòu)則不能纏繞在CNTs表面。本文利用這種性質(zhì)的差異，將TAMRA－polyT21纏繞在CNTs上，TAMRA－polyT21中修飾的熒光基團(tuán)TAMRA的熒光能被有效地猝滅；而T－Hg－T復(fù)合物形成類似于dsDNA的性質(zhì)則不能纏繞在CNTs，TAMRA的熒光得到恢復(fù)，基于此原理，建立了一種用熒光法快速靈敏地檢測(cè)Hg2＋的分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)方法

儀器采用日立F－2700型熒光分光光度計(jì)（日本）用于表征熒光光譜；pHS－3C型酸度計(jì)（上海雷磁儀器公司）用于調(diào)節(jié)體系的pH值；QL－901型旋渦混合器（上海天呈醫(yī)流生物醫(yī)學(xué)公司）用于混合溶液。

材料采用碳納米管（CNTs）購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所（經(jīng)混酸處理后備用）。DNA（TAMRA－polyT21）購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（中國(guó)），用去離子水溶解配成溶液后于4℃冰箱中避光保存。實(shí)驗(yàn)中使用0.1mL磷酸鹽緩沖，其他試劑均為分析純。

向1.0mL離心管中，保持V總為500L的條件下，按順序依次加入上述50L緩沖溶液（pH值為7.0），一定量的TAMRA－polyT21溶液和HgCl2溶液，反應(yīng)一段時(shí)間后，加入CNTs，再反應(yīng)一段時(shí)間后以15000r／min的速度離心15min，測(cè)定上清液熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為550nm發(fā)射波長(zhǎng)為579nm，狹縫均為5.0nm，電壓為700V，室溫檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光光譜表征

如圖1所示，空白樣品中，TAMRA－polyT21處于自由卷曲狀態(tài)，能很好地纏繞在CNTs表面，TAMRA熒光被猝滅，因此體系中579nm處的熒光值很低；當(dāng)一系列濃度的 Hg2＋存在時(shí)，由于T－Hg－T的作用，TAMRA－polyT21發(fā)生折疊，有了一定的剛性，不能纏繞在CNTs表面，因此體系在579nm處熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。從內(nèi)嵌圖可以明顯地看出，579nm處的熒光強(qiáng)度與加入Hg2＋的濃度呈線性增加的趨勢(shì)，到0.9μm時(shí)增加達(dá)到最大，之后達(dá)到一個(gè)平臺(tái)。

實(shí)驗(yàn)條件：激發(fā)波長(zhǎng)為550nm，發(fā)射波長(zhǎng)為579nm；pH值為7.0，CNTs濃度為19mg／L；DNA濃度為0.11M；Hg2＋濃度（曲線a k，μm）分別為：0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1.0、0.7、1.2、0.8、0.9。

3.2 CNTs用量?jī)?yōu)化

圖1 熒光光譜圖

體系中CNTs的用量是個(gè)關(guān)鍵因素，直接影響到體系中熒光的猝滅和恢復(fù)效率，因此，對(duì)體系中CNTs用量進(jìn)行了優(yōu)化：固定TAMRA－polyT21的量為0.11μm時(shí)，加入不同量的CNTs。隨著CNTs用量的逐漸增加，TAMRA－polyT21在579nm處的熒光逐漸被猝滅，最后達(dá)到一個(gè)平臺(tái)，熒光變化不大，因此確定CNTs的最佳用量為19mg／L。

3.3 時(shí)間的優(yōu)化

考察了CNTs與TAMRA－polyT21、T－Hg－T復(fù)合物孵育的時(shí)間對(duì)檢測(cè)Hg2＋時(shí)熒光強(qiáng)度的影響，考察了1h之內(nèi)體系熒光強(qiáng)度的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與空白值相對(duì)比，Hg2＋加入形成T－Hg－T復(fù)合物后反應(yīng)初期，體系的熒光強(qiáng)度增加，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，體系熒光增加的程度呈下降趨勢(shì)，直到15min后體系的熒光增強(qiáng)值變化不大，因?yàn)榇_定最佳孵育時(shí)間為15min。

3.4 與其他金屬離子比較

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，考察了一些常見金屬離子如Pb2＋、Cu2＋、Fe3＋等的在該檢測(cè)中的響應(yīng)，即其條件相同的情況下，用其他金屬離子代替Hg2＋進(jìn)行整個(gè)實(shí)驗(yàn)。用（IF－I0）／I0作為參數(shù)進(jìn)行比較，即體系的熒光強(qiáng)度（IF）減去空白樣品的熒光（IF0）的差值除以空白樣品的熒光（I0），當(dāng)加入相同濃度的其他金屬離子后，與空白值相比，體系的熒光強(qiáng)度值增加不大，即（IF－I0）／I0不大，幾乎可以忽略；當(dāng)加入相同濃度的Hg2＋后，與空白值相比，體系的熒光強(qiáng)度值增加很明顯，即（IF－I0）／I0比較大，以此證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)建立的基于CNTs建立的熒光法檢測(cè)Hg2＋的方法具有選擇性和特異性。

3.5 分析測(cè)定

按實(shí)驗(yàn)方法，在優(yōu)化條件下，發(fā)現(xiàn)體系在波長(zhǎng)為579nm處的熒光強(qiáng)度（IF）與 Hg2＋的濃度在0.2μm～0.9μm范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。線性回歸方程為：IF＝－18.5＋698.9c，相 關(guān) 系 數(shù) 為 0.9920，檢 出 限 為0.025μm。此外，用達(dá)州洲河水進(jìn)行了實(shí)際樣品檢測(cè)，Hg2＋的回收率在97.4%～103.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.3%。

4 結(jié)語(yǔ)

本文報(bào)道了一種快速、靈敏地檢測(cè)Hg2＋的新方法。與其他金屬離子相比，該檢測(cè)Hg2＋的方法具有很好的選擇性，并且陰陽(yáng)離子共存物幾乎無(wú)干擾，可以用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

［1］Xue X，Wang F，Liu X.One－step，room temperature，colorimetric detection of mercury（Hg2＋）using DNA／nanoparticle conjugates［J］.Am Chem Soc，2008（130）：3244～3245.

［2］Yuan T，Liu Z，Hu L.Label－free supersandwich electrochemiluminescence assay for detection of sub－nanomolar Hg2＋［J］.Chem Commun，2011（47）：11951～11953.

［3］Guo W，Yuan J，Wang E.Oligonucleotide－stabilized Ag nanoclusters as novel fluorescence probes for the highly selective and sensitive detection of the Hg2＋ion［J］.Chem Commun，2009（12）：3395～3397.

［4］Liu Z D，Li Y F，Ling J.A localized surface plasmon resonance light－scattering assay of mercury（II）on the basis of Hg2＋－DNA complex induced aggregation of gold nanoparticles［J］.Environ Sci Technol，2009（43）：5022～5027.

［5］Chiang C K，Huang C C，Liu C W.Oligonucleotide－based fluorescence probe for sensitive and selective detection of mercury（II）in aqueous solution［J］.Anal Chem，2008（80）：3716～3721.

［6］Yang R，Jin J，Chen Y.Carbon nanotube－quenched fluorescent oligonucleotides：probes that fluoresce upon hybridization［J］.Am Chem Soc，2008（130）：8351～8358.