王剛李二峰茆振川楊宇紅謝丙炎

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部蔬菜遺傳改良重點開放實驗室，北京 100081）

南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）發(fā)生普遍，尤其在設(shè)施栽培中發(fā)病更為嚴(yán)重。每年對各種農(nóng)作物造成的損失達(dá)到幾十億美元（Barker & Koenning，1998）。根結(jié)線蟲侵染后，在黃瓜（Cucumis sativusL.）根部形成根結(jié)，根部吸收功能被破壞，造成地上部矮小、黃化甚至葉片脫落。鐮刀菌（FusariuMspp.）普遍存在于土壤中，世界各地廣泛分布，分為致病菌和非致病菌。在土壤中，大量的菌株是非致病的，在土壤中起著未知作用。鐮刀菌和根結(jié)線蟲都是植物的重要病原物，這兩種病原物之間在寄主植物中存在著非常復(fù)雜的互作關(guān)系。植物寄生性線蟲通常能夠促進(jìn)植物病原菌的侵染及擴(kuò)展，從而引起嚴(yán)重的病害（Mai & Abawi，1987）。在田間已經(jīng)報道根結(jié)線蟲的侵染可以加重番茄、甘藍(lán)、棉花、煙草枯萎病的發(fā)生（Mai & Abawi，1987）。然而，一些非致病性的菌株被認(rèn)為是內(nèi)寄生性的共生菌，它們能在許多植物的根組織中定殖，但是并不引起病害，而且能夠增加植物對真菌病害及植物寄生線蟲的抗性（Olivain &Alabouvette，1997；Diedhiou et al.，2003；Vu et al.，2006）。

由于栽培黃瓜中未發(fā)現(xiàn)抗南方根結(jié)線蟲的種質(zhì)資源，在生產(chǎn)中化學(xué)防治仍然是防治根結(jié)線蟲的重要措施，如滅線磷、溴化鉀和百畝威等（梁建根和鄭經(jīng)武，2010）。這些藥劑雖然殺蟲快，但是會嚴(yán)重降低蔬菜質(zhì)量，污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，因此生物防治措施日益受到人們的關(guān)注。國外已經(jīng)利用節(jié)叢孢菌（Arthrobotrysspp.）開發(fā)成商品菌劑 Royale350，利用巴斯德桿菌（Pasteuria）防治南方根結(jié)線蟲的研究也有報道（Siddiqui et al.，2001）。這些捕食性真菌和寄生性細(xì)菌在土壤中可以有效地防治線蟲，但是捕食性真菌對于線蟲的捕食是非選擇性的，而巴斯德桿菌為專性寄生等特性都限制其高效發(fā)展（范圣長 等，2004）。所以人們開始尋求能夠定殖于植物內(nèi)的真菌來防治線蟲。

尖孢鐮刀菌Cu02能夠定殖于植物體內(nèi)，是一種非致病的尖孢鐮刀菌，張小艷等（2007）報道了鐮刀菌是根結(jié)線蟲拮抗真菌的優(yōu)勢種群。目前還沒出現(xiàn)抗線蟲的黃瓜品種。尖孢鐮刀菌能定殖于黃瓜體內(nèi)，所以在其與其他土壤真菌競爭的過程中，就有了很大的優(yōu)勢，在防治線蟲的作用上，就有了“守株待兔”的效果。總之，用這樣一種對線蟲有拮抗作用、對黃瓜非致病的、定殖于植株體內(nèi)的的真菌來防治根結(jié)線蟲，會穩(wěn)定的發(fā)揮防效，而且對植物沒有影響。所以本試驗對尖孢鐮刀菌Cu02對黃瓜的致病性以及防治南方根結(jié)線蟲的效果進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試黃瓜品種 9330由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所黃瓜課題組提供。尖孢鐮刀菌 Cu02菌株為黃瓜內(nèi)分離到的內(nèi)生菌，由本所病害實驗室提供；南方根結(jié)線蟲采自市北京市海淀區(qū)四季青農(nóng)場，并在溫室中進(jìn)行單卵塊繁殖，收集卵塊孵化的2齡幼蟲，于2011年5月6日用于接種試驗。

1.2 尖孢鐮刀菌Cu02在黃瓜上的定殖

1.2.1 尖孢鐮刀菌接種方法 將黃瓜（9330）種子用5%的NaClO消毒10 min，用無菌水清洗干凈后29 ℃催芽1 d，播種于苗盤中，以滅菌土為介質(zhì)在25～28 ℃溫室中萌發(fā)、培養(yǎng)。當(dāng)黃瓜兩片子葉完全展開時將幼苗根部土壤輕輕洗掉，用于接種試驗。鐮刀菌接種采用浸根法，將幼苗根部在濃度為2.8×106個·mL-1的孢子懸浮液中浸泡15 min，然后定植于苗缽（規(guī)格:10 cm×10 cm×15 cm）中，以滅菌土為基質(zhì)在25～28 ℃溫室中培養(yǎng)，接種7 d時檢測尖孢鐮刀菌Cu02的侵染情況，在21 d時檢測尖孢鐮刀菌Cu02對黃瓜9330的致病性。每處理接種20株幼苗，3次重復(fù)，并以清水模擬接種為對照。

1.2.2 Cu02定殖檢測 接種7 d時，將黃瓜幼苗根部土壤輕輕沖洗掉，除去須根和葉片只保留莖稈，用70%乙醇處理30 s，然后用0.5%的NaClO 處理3 min，用無菌水沖洗3次，將莖稈切成0.5 cm的小段，在含有鏈霉素（150 mg·L-1）的PDA培養(yǎng)基上分離接種的尖孢鐮刀菌Cu02，于28 ℃避光培養(yǎng)，3 d后觀察內(nèi)生真菌的分離情況。調(diào)查尖孢鐮刀菌Cu02在接種黃瓜幼苗上的侵染、定殖情況。并在接種尖孢鐮刀菌Cu02菌株7、21 d時，分別觀察植株的癥狀，調(diào)查黃瓜生長情況。

若有菌落長出，挑取菌絲，在顯微鏡下觀察菌絲及孢子特征。挑取單胞，在新的PDA平板上28 ℃培養(yǎng)5 d，用刀片刮取菌絲，采用改良CTAB法提取基因組DNA（曹宜 等，2004），以引物 EF-F:5’-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3’和 EF-R:5’-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3’對分離菌進(jìn)行分子鑒定（Mbofung et al.，2007）。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃ 4 min，1個循環(huán)；95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 50 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將DNA片段進(jìn)行切膠回收（Transgene），連接到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化到Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有 IPTG（40 mg·L-1）、X-GAL（20 mg·L-1）及 AMP（100 mg·L-1）的 LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。37 ℃ 16 h后挑取白色菌落經(jīng)PCR檢測呈陽性的克隆進(jìn)行測序（三博遠(yuǎn)志公司）。將獲得的核苷酸序列在 NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行對比，在分子水平上鑒定菌株的種類。

1.3 Cu02對黃瓜根結(jié)線蟲的防治效果

1.3.1 接種南方根結(jié)線蟲 挑取成熟的南方根結(jié)線蟲卵塊，用0.1%的NaClO消毒5 min，無菌水清洗3次，置于28 ℃下孵化，24 h后收集2齡幼蟲（J2）用于接種試驗。在接種尖孢鐮刀菌Cu02 7 d后，接種南方根結(jié)線蟲。接種時在距離黃瓜根2 cm處的基質(zhì)中均勻打3個1 cm深的小孔，注入南方根結(jié)線蟲懸浮液，每株接種南方根結(jié)線蟲400條，每個處理接種20株，3次重復(fù)，并且以清水模擬接種為對照。接種后的幼苗在溫室中進(jìn)行正常管理。

1.3.2 防效檢測 在黃瓜接種南方根結(jié)線蟲21 d后，將黃瓜幼苗根部土壤輕輕洗凈沖洗掉，觀察根部癥狀，檢測根結(jié)，統(tǒng)計大根結(jié)和小根結(jié)數(shù)量，并用 SAS軟件（9.1）anova程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行方差分析。同時通過根結(jié)減退率計算Cu02對南方根結(jié)線蟲的防治效果。

1.3.3 根結(jié)內(nèi)鐮刀菌分離檢測 在接種和未接種尖孢鐮刀菌 Cu02的黃瓜植株中，隨機(jī)挑取 10株，每株分別隨機(jī)切下20個根結(jié)，用1%的NaClO消毒10 min后，在含有鏈霉素（150 mg·L-1）的PDA培養(yǎng)基上分離尖孢鐮刀菌Cu02，每個培養(yǎng)皿放置來自同一植株的20個根結(jié)，于28 ℃避光培養(yǎng)，3 d后觀察根結(jié)內(nèi)鐮刀菌的分離情況。菌落的顯微觀察及分子鑒定方法同1.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體寄生定殖檢測

2.1.1 Cu02在黃瓜植株內(nèi)的定殖檢測 經(jīng)過表面消毒的莖段在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，被檢測的30株植株每株根部和莖基部莖段都有白色的菌絲長出，形成菌落。培養(yǎng)7 d時植株的絕大部分莖段都有白色的菌絲長出，莖段中出現(xiàn)菌落的概率達(dá)到 91.0%，只有少數(shù)頂部莖段沒有分離到菌絲（圖 1-B），而對照中的所有莖段都沒有分離到白色的菌絲（圖 1-A）。說明尖孢鐮刀菌Cu02可以成功的在黃瓜植株內(nèi)定殖，而且在根部和莖基部的定殖率最高，達(dá)到100%。

2.1.2 Cu02在根結(jié)內(nèi)的定殖檢測 在PDA培養(yǎng)基上，每株接種Cu02的黃瓜植株上都有一些根結(jié)能分離到尖孢鐮刀菌Cu20，并生長形成菌落（圖2-B）。但并不是每個根結(jié)都能分離出菌落。對分離到鐮刀菌的根結(jié)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)Cu02在根結(jié)內(nèi)的定殖率只有11.9%。而未接種Cu02的對照黃瓜植株上的根結(jié)中未分離到任何真菌（圖2-A）。

2.1.3 菌體形態(tài)及分子檢測 在莖段和根結(jié)上分離到的尖孢鐮刀菌，培養(yǎng)3 d時菌絲均勻的覆蓋莖段或根結(jié)表面，菌落菌呈現(xiàn)為白色的絨毛狀；培養(yǎng) 7 d時菌絲進(jìn)一步生長，密度加大，在根結(jié)上的菌落呈現(xiàn)為以根為中心圓形，菌絲成茸氈狀，菌落的顏色也變?yōu)榈奂t色。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有隔菌絲，孢子有小型分生孢子和大型分生孢子（圖3）。小型分生孢子多數(shù)為單細(xì)胞，偶有一個隔膜，長橢圓形或短桿狀，無色；大型分生孢子呈鐮刀形，少許彎曲，以 3個隔膜為主，具有尖孢鐮刀菌的典型形態(tài)特征。兩種分離菌的形態(tài)特征與Cu02菌株完全一致。

圖1 黃瓜接種Cu02 7 d時組織分離菌株生長情況

圖2 尖孢鐮刀菌Cu02在根結(jié)內(nèi)的定殖檢測結(jié)果

圖3 菌體的顯微檢測結(jié)果

將在莖段及根結(jié)上分離到的菌株進(jìn)行單胞培養(yǎng)，以提取的基因組DNA為模板，用EF引物擴(kuò)增，在兩種分離菌落中都得到了大小相等的片段（圖4），采用DNAMAN（5.0）軟件比較測序結(jié)果，顯示兩片段均為710 bp，且序列相同。在 NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST，與FusariuMoxysporum的轉(zhuǎn)錄延長因子片段一致性達(dá)到 100%，排除期望值為 0，與 Cu02菌株的轉(zhuǎn)錄延長因子片段的核苷酸序列完全一致。

結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子鑒定結(jié)果分析證實，從莖段及根結(jié)中分離到的菌株均為接種的尖孢鐮刀菌Cu02，也進(jìn)一步證明Cu02菌株可以在黃瓜9930植株內(nèi)定殖。

圖4 EF引物擴(kuò)增條帶

2.2 防治南方根結(jié)線蟲效果

接種Cu02菌株7、21 d時，對照與處理均未發(fā)現(xiàn)發(fā)病植株，植株生長健壯，長勢良好無病癥（圖5）。在接種南方根結(jié)線蟲28 d后，調(diào)查根結(jié)情況，發(fā)現(xiàn)Cu02處理與對照的黃瓜幼苗在根結(jié)大?。▓D6）、數(shù)量（圖7）上存在差異。在Cu02處理的植株上，小根結(jié)數(shù)量平均為68.8個·株-1，大根結(jié)（Ф＞2 mm）數(shù)量平均為3.5個·株-1；而在對照中，小根結(jié)平均為101.9個·株-1，大根結(jié)為14.8個·株-1（圖8）。通過SAS軟件anova程序?qū)μ幚砼c對照中的小根結(jié)數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)F=15.18，P=0.000 3，證實處理與對照中的小根結(jié)數(shù)量存在顯著差異；而對其中的大根結(jié)的數(shù)量進(jìn)行方差分析，得到F=56.92，P＜0.000 1，說明處理與對照植株上的大根結(jié)數(shù)量存在著極顯著差異。按根結(jié)減退率公式計算得到，Cu02對黃瓜的根結(jié)減退率達(dá)到38.0%。這些結(jié)果表明非致病尖孢鐮刀菌Cu02在黃瓜上對于南方根結(jié)線蟲具有一定的防治效果。

圖5 黃瓜接種尖孢鐮刀菌Cu02后的癥狀

圖6 Cu02處理后根結(jié)大小情況

圖7 Cu02處理后南方根結(jié)線蟲侵染癥狀

圖8 Cu02處理與對照黃瓜的根結(jié)數(shù)量

3 討論

通過本試驗證明非致病尖孢鐮刀菌Cu02可以成功的在黃瓜植株內(nèi)定殖，在根部的定殖率可以達(dá)到100%，而且對黃瓜的生長沒有任何影響，這就形成了Cu02防治根結(jié)線蟲的獨特優(yōu)勢。根結(jié)線蟲侵染植物的根部，形成根結(jié)，為害作物。而非致病性尖孢鐮刀菌可以較早的在植物的根部定殖，對根結(jié)線蟲的侵染、寄生及根結(jié)發(fā)育產(chǎn)生一定影響，從而對植物形成保護(hù)作用?，F(xiàn)在已經(jīng)有很多關(guān)于非致病鐮刀菌防治根結(jié)線蟲的報道（Diedhiou et al.，2003）。在國內(nèi)，已經(jīng)證明了鐮刀菌對根結(jié)線蟲的毒殺特性，尖孢鐮刀菌是根結(jié)線蟲的拮抗菌，作為根結(jié)線蟲生防菌具有巨大潛力（段玉璽 等，2010）。有關(guān)研究表明，鐮刀菌可以產(chǎn)生某些代謝產(chǎn)物毒殺卵粒，再定殖于卵，影響其發(fā)育（劉國坤 等，2006）。相對于土壤中的尖孢鐮刀菌，非致病性植物內(nèi)寄生尖孢鐮刀菌在防治根結(jié)線蟲上具有獨特的優(yōu)勢。首先，由于內(nèi)定殖特性使得菌株受到外界其他微生物競爭作用較小，有利于穩(wěn)定的發(fā)揮防效；其次，非致病性鐮刀菌為絲狀真菌，為采用生物技術(shù)改造提供了高效的技術(shù)平臺試驗載體，隨著生物技術(shù)的發(fā)展將殺線蟲的特異基因如蛋白酶基因等轉(zhuǎn)入菌絲，在植物根部特異表達(dá)殺線蟲基因，從而大大提高了防治植物寄生性線蟲的效果。特別是在當(dāng)前黃瓜還沒有可利用的抗根結(jié)線蟲品種條件下，更加具有重要的研究意義。

在黃瓜上，尖孢鐮刀菌Cu02顯示出對南方根結(jié)防治效果為38.0%，雖為顯著，但還不理想。試驗發(fā)現(xiàn)，Cu02在黃瓜植株根部的定殖率達(dá)到100.0%，然而在根結(jié)中的定殖率只有11.9%，這可能與Cu02對根結(jié)線蟲的防治效果較低有直接的關(guān)系。所以提高Cu02的防治效果的關(guān)鍵就在于提高Cu02在黃瓜植株內(nèi)的存在數(shù)量及存活能力。在接種條件、接種時間及接種的最佳孢子濃度上需要深入探索，從而進(jìn)一步提高對根結(jié)線蟲的防治效果。此外，可以嘗試尖孢鐮刀菌Cu02與化學(xué)藥劑的聯(lián)合使用，有利于制備出更高效的生防菌劑。

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