王欣放

[摘要] 目的 建立清開靈注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。 方法 采用《中華人民共和國(guó)藥典》（2010年版）附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，考察清開靈注射液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾作用，確定其最大不干擾濃度。 結(jié)果 清開靈注射液稀釋至60倍后可消除干擾作用，使用靈敏度為0.125 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，無干擾因素的影響。 結(jié)論 使用鱟試劑檢查清開靈注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的，可以用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法取代熱原檢查法。

[關(guān)鍵詞] 清開靈注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查；鱟試劑；干擾試驗(yàn)

[中圖分類號(hào)] R285.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號(hào)] 1674-4721（2012）07（c）-0081-03

The establish of Bacterial Endotoxin test method for Qingkailing injection

WANGXinfang

The Food and Drug Safety Supervision of Chaoyang City in Liaoning Province, Chaoyang 122000, China

[Abstract] Objective To establish the bacterial endotoxin test method for Qingkailing injection. Methods The bacterial endotoxins test of appendix in China Pharmacopoeia (2010 version) was used to investigate the interference effect of Qingkailing injection in the bacterial endotoxin test method, and the maximum noninterference concentration was confirmed. Results The interference effect could be eliminated when Qingkailing injection was diluted 60 times. When the sensitive of tachypleus amebocyte lysate with 0.125 EU/mL to do the bacterial endotoxins test, the results were no interference. Conclusion It is feasible to check the bacterial enolotoxin in Qingkailing injection by using tachypleus amebocyte lysate, and the bacterial enolotoxin test method can replaced the pyrogen test method.

[Key words] Qingkailing injection; Bacterial endotoxin test; Tachypleus amebocyte lysate; Interference test

清開靈注射液是由中藥復(fù)方制備而成的供靜脈滴注的注射劑，具有清熱解毒，化痰通絡(luò)，醒神開竅之功效，已被廣泛應(yīng)用于多種不同臨床適應(yīng)癥。該注射液現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國(guó)藥典》（2010年版）[1]1110規(guī)定的檢查項(xiàng)是熱原檢查法，本文參考《中華人民共和國(guó)藥典》（2010年版）附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”等文獻(xiàn)[1]附錄88[2-4]進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)清開靈注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的可行性進(jìn)行探討，為建立該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試劑

1.1 儀器

ZH-2型自動(dòng)旋渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；DR-HW-1電熱恒溫水浴箱（天津醫(yī)療器械廠）；微量移液器50～250 μL，200～1 000 μL （上海精密儀器廠）。

1.2 試劑

鱟試劑（以下簡(jiǎn)稱TAL）[批號(hào)1：1004026，靈敏度（λ）：0.25 Eu/mL，0.1 mL/支；批號(hào)2：1012082，靈敏度（λ）：0.125 Eu/mL，0.1 mL/支；批號(hào)3：1008125，靈敏度（λ）：0.25 Eu/mL，0.1 mL/支；批號(hào)4：1010110，靈敏度（λ）：0.125 Eu/mL，0.1 mL/支。其中，批號(hào)1、2由湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)，批號(hào)3、4由湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)]。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（以下簡(jiǎn)稱BET水）（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：201012，規(guī)格：10 mL/支）。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（以下簡(jiǎn)稱CSE）（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：150601-201174，160 Eu /支）。

清開靈注射液 （神威藥業(yè)有限公司，批號(hào)：10050912、10081123、10042410，規(guī)格：2 mL/支；山西太行藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：100527、100212、100610，規(guī)格：2 mL/支）。

2 方法與結(jié)果

2.1鱟試劑靈敏度（λ）的復(fù)核

按《中華人民共和國(guó)藥典》（2010年版）的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行靈敏度復(fù)核和結(jié)果判斷，用BET水將CSE按1→2等比稀釋成系列濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液，然后與鱟試劑混合置于37 ℃恒溫水浴60 min。4批鱟試劑λc（鱟試劑靈敏度的測(cè)定值）均在0.5 λ～2.0 λ（包括0.5 λ和2.0 λ）之間。見表1。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）計(jì)算

根據(jù)公式L=K/M，L為供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值，K為人每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑為5.0 Eu/（kg·h）。M為人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量，清開靈注射液最大人用劑量為40 mL/d[5]，以10%葡萄糖注射液200 mL或NaCl注射液100 mL稀釋后使用，1 h內(nèi)靜脈滴注，成人體重按60 kg計(jì)，計(jì)算L=5.0/40/60=7.5 Eu/mL。

2.3 供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）[2]

根據(jù)公式MVD=C×L/λ確定供試品的最大有效釋倍數(shù)范圍，供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L為7.5 EU/mL，C為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以Eu/mL 表示時(shí)，則C等于1.0 mL/mL，鱟試劑的靈敏度（λ）通常為0.03～0.50 EU/mL。計(jì)算出供試品的最大有效稀釋倍數(shù)范圍，即：MVDmin＝1.0×7.5/0.5＝15倍；MVDmax＝1.0×7.5/0.03＝250倍。

2.4 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)

按中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范進(jìn)行[6]，用BET水分別將2個(gè)廠家的清開靈注射液依次稀釋成15、30、60、120、240倍系列濃度的藥液，記作“NPC系列”，另制備同樣系列濃度的供試液，并使每一供試液均含有2 λ濃度（0.5 EU/mL）的內(nèi)毒素溶液記作“PPC系列”。每一濃度設(shè)兩管，與靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行反應(yīng)，設(shè)陰性（NC）和陽性（PC）對(duì)照管，混勻后封口，置37 ℃恒溫水浴60 min，見表2。

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，供試品濃度在15～30倍的稀釋范圍內(nèi)對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用，供試品濃度在60～240倍的稀釋范圍內(nèi)對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)無干擾。筆者選用2個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行比較，證明不同廠家的供試品結(jié)果一致。

2.5 供試品的干擾試驗(yàn)[2]

細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：用BET水將CSE稀釋成2 λ﹑1 λ﹑0.5 λ﹑0.25 λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

供試品內(nèi)毒素溶液的制備：分別用兩個(gè)廠家的清開靈注射液的60倍稀釋液將同一支CSE分別制成2 λ﹑1 λ﹑0.5 λ﹑0.25 λ的供試品內(nèi)毒素溶液。使用2個(gè)廠家的鱟試劑與上述2個(gè)內(nèi)毒素溶液反應(yīng)，并同時(shí)做陰性對(duì)照（NC）及供試品陰性對(duì)照（NPC）。見表3。

結(jié)果顯示，選用2個(gè)廠家的鱟試劑，不同廠家6個(gè)批次清開靈注射液的60倍稀釋液均無干擾，其 Es（用BET水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值）在0.5～2.0 λ（包括0.5 λ和2.0 λ）且Et（用供試品稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值）均在0.5 Es～2.0 Es之間，符合藥典規(guī)定。說明供試品在60倍稀釋后對(duì)試驗(yàn)無干擾作用。

2.6 供試品內(nèi)毒素的檢查

將6批供試品用BET水制成60倍稀釋液，用此濃度稀釋液將CSE稀釋為2 λ濃度的溶液，作為供試品陽性對(duì)照，取靈敏度（λ）：0.125 Eu/mLTAL進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，見表4。

3 討論

（1）通過干擾預(yù)試驗(yàn)初步確定了清開靈注射液最小不干擾稀釋倍數(shù)，這樣既可以減少做干擾試驗(yàn)的盲目性，又可以減少試劑消耗及節(jié)省時(shí)間；（2）清開靈注射液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有干擾作用，但其干擾作用可通過對(duì)樣品溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尩靡耘懦齕7]。應(yīng)用2個(gè)廠家的TAL，不同廠家6個(gè)批次清開靈注射液的60倍稀釋液做干擾實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明均無干擾作用，且供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素常規(guī)檢查結(jié)果為陰性，此時(shí)可建立該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法[8]。說明清開靈注射液可以由細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法取代熱原檢查法。

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（收稿日期：2012-04-28本文編輯：魏玉坡）