馮 鑫， 汪長(zhǎng)中， 汪天明， 徐振華， 韓 寧， 程惠娟， 官 妍， 王 艷

(安徽中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽合肥230038)

近年來(lái)，以白念珠菌為主的機(jī)會(huì)性真菌感染發(fā)生率正逐年升高，尤其是其引起的深部感染往往成為真菌感染致死的主要原因［1］。同時(shí)，臨床上抗真菌藥物不僅種類少，對(duì)肝腎等器官毒副作用大，且易產(chǎn)生耐藥性，因此真菌感染成為臨床上棘手的難題。目前，從天然產(chǎn)物尤其是中藥中篩選抗真菌藥物并深入研究其抗菌機(jī)制成為近年來(lái)抗真菌藥物研發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥有效成分黃芩苷對(duì)白念珠菌具有較強(qiáng)的抑制作用，但黃芩苷是否能誘導(dǎo)白念珠菌凋亡尚不明確［2-3］。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討黃芩苷體外對(duì)白念珠菌凋亡的影響，為其抗真菌感染提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基、試劑和儀器 白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231與黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品 (批號(hào)110715-201016)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，沙氏培養(yǎng)基購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于GIBCO公司，羅丹明123(Rh123)與Hoechst 33258購(gòu)于 Sigma公司，二氫羅丹明(DHR)與蝸牛酶購(gòu)于Ruibio公司。流式細(xì)胞儀XL為Beckman Coulter公司，熒光顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品。

1.2菌液的制備 將白念珠菌劃線接種于SDA培養(yǎng)后，挑選2個(gè)菌落接種于RPMI-1640(含10%小牛血清)培養(yǎng)基中稀釋，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再以RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液密度為1×107/mL。

1.3 凋亡的藥物誘導(dǎo)及脫壁處理［4］在白念珠菌懸液 (1×107/mL)中分別加入黃芩苷1 000，100，10 μmol/L，37℃靜置作用16 h，另設(shè)不加藥的正常對(duì)照組 (每組n=6)。冷PBS洗2次，然后參照文獻(xiàn)［4］對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行脫壁處理:即加入脫壁促進(jìn)劑 (50 mmol/L K2HPO4，5 mmol/L EDTA，50 mmol/L DTT)，30℃、100 r/min搖床孵育30min，PBS洗滌2次，再轉(zhuǎn)移至1.5%蝸牛酶溶液中，30℃、100 r/min搖床孵育45 min，即得脫壁后原生質(zhì)體狀態(tài)的白念珠菌。冷PBS洗2次后，用于下述流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS與MMP。

1.4 Hoechst 33258熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)改變?cè)诎啄钪榫鷳乙?(1×107/mL)中分別加入黃芩苷1 000，100，10 μmol/L，作用 16 h，PBS洗兩次，另設(shè)正常對(duì)照組。加入4%多聚甲醛 (新鮮配制)，固定細(xì)胞 (4℃15 min)，加入Hoechst 33258(5 mg/L)染色液作用15 min，PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 在脫壁的原生質(zhì)體狀態(tài)白念珠菌細(xì)胞懸液中，加入10 μmol/L的DHR 500 μL，室溫下避光孵育1 h，PBS洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Rh123的平均熒光指數(shù) (mean fluorescence index，MFI)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位 (mitochondrial membrane exponential，MMP) 用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將1 g/L的Rhl23(溶于DMSO，儲(chǔ)存于-20℃)稀釋至終質(zhì)量濃度10 mg/L，加入原生質(zhì)體狀態(tài)白念珠菌懸液中，37℃避光孵育30 min，冷PBS洗滌5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MMP。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，由SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對(duì)白念珠菌細(xì)胞形態(tài)的影響 熒光顯微鏡高倍鏡 (×400)下，Hoechst 33258染色顯示，正常對(duì)照組的白念珠菌細(xì)胞核呈彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光 (圖 1A)。100 μmol/L，1000 μmol/L 濃度黃芩苷組的菌細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的核濃染致密、固縮狀態(tài)或顆粒狀熒光 (圖1C，1D)，但10 μmol/L黃芩苷組的菌細(xì)胞未見(jiàn)明顯凋亡征象 (圖1B)。油鏡下 (×1 000)，可更清晰見(jiàn)到正常菌細(xì)胞的均勻一致的熒光密度，而凋亡菌細(xì)胞核則呈明顯濃縮、核碎裂等表現(xiàn) (圖1E，1F)。

圖1 熒光顯微鏡觀察不同濃度黃芩苷對(duì)白念珠菌形態(tài)的影響Fig.1 Fluorescence microscopic observation of the morphological changes of Candida albicans cells exposed to baicalin

2.2 黃芩苷對(duì)白念珠菌線粒體膜電位 (MMP)的影響 黃芩苷作用于白念珠菌細(xì)胞后，反映MMP的平均熒光指數(shù) (MFI)隨著藥物濃度的升高而降低。正常對(duì)照組 MMP值為202.88±12.20，10 μmol/L組MMP值為189.60±11.57，兩者無(wú)顯著性差 異。100 μmol/L，1 000 μmol/L 濃 度 組 的MMP值分別為167.46±9.61和161.38±9.10，與正常對(duì)照組相比較，有顯著性差異 (P＜0.05)，但100 μmol/L和1 000 μmol/L濃度組之間MMP值無(wú)顯著性差異，見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)黃芩苷作用后的白念珠菌線粒體膜電位Fig.2 Flow cytometryic analysis of MMP in baicalin-treated Candida albicans

2.3 黃芩苷對(duì)白念珠菌胞內(nèi)活性氧 (ROS)水平的影響 黃芩苷作用于白念珠菌細(xì)胞后，反映ROS水平的平均熒光指數(shù) (MFI)隨著藥物濃度的遞增而升高。正常對(duì)照組細(xì)胞釋放ROS水平較低，MFI為28.50 ±2.16，而 10 μmol/L 組、100 μmol/L組、1 000 μmol/L組的MFI分別為54.98±4.30，78.16±5.86和145.38±9.70，與正常對(duì)照組相比，有顯著性差異 (P＜0.05)，黃芩苷濃度越高誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞釋放出的ROS越多，見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)黃芩苷作用后的白念珠菌胞內(nèi)活性氧 (ROS)水平Fig.3 Flow cytometryic analysis of intracellular ROS accumulation in baicalin-treated Candida albicans

3 討論

黃芩苷 (baicalin)是中藥黃芩的主要有效成分。有文獻(xiàn)報(bào)道，黃芩苷具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗內(nèi)毒素休克等藥理活性［5］，并對(duì)皮膚致病性真菌與多種細(xì)菌在內(nèi)的病原微生物均具有較強(qiáng)的抑制作用［6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對(duì)白念珠菌的黏附及生物被膜形成具有一定的抑制作用［2-3］;熊英等證實(shí)黃芩苷體外通過(guò)抑制白念珠菌的DNA、RNA、蛋白質(zhì)的生物合成導(dǎo)致菌細(xì)胞死亡而起到殺菌作用［7］。但黃芩苷是否能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)抗白念珠菌尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究即是在原有工作基礎(chǔ)上對(duì)黃芩苷抗白念珠菌作用機(jī)制的進(jìn)一步深入探討。

凋亡是真核細(xì)胞常見(jiàn)的生理現(xiàn)象，白念珠菌為真核微生物，近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)白念珠菌也存在凋亡現(xiàn)象。Phillips與楊丞喆等用乙酸成功地誘導(dǎo)白念珠菌凋亡［4，8］;AL-Dhaheri等也觀察到兩性霉素 B能誘導(dǎo)生物被膜狀態(tài)的白念珠菌發(fā)生凋亡［9］。這些研究表明有望通過(guò)藥物誘導(dǎo)白念珠菌凋亡作為抗真菌的一個(gè)重要手段。

細(xì)胞凋亡過(guò)程中，細(xì)胞核會(huì)發(fā)生固縮、碎裂、溶解等一系列變化。本實(shí)驗(yàn)中，1 000，100 μmol/L的黃芩苷作用后，熒光顯微鏡下能直接觀測(cè)到經(jīng)Hoechst 33258染色所顯示的細(xì)胞核形態(tài)變化，即白念珠菌細(xì)胞核呈濃染致密、固縮狀態(tài)或顆粒狀熒光，但10 μmol/L的黃芩苷對(duì)菌細(xì)胞核無(wú)明顯影響。

線粒體不僅是維持細(xì)胞生命活動(dòng)重要的細(xì)胞器，同時(shí)也在凋亡通路中發(fā)揮重要作用。一定水平的線粒體膜電位 (MMP)的維持是線粒體發(fā)揮功能的必要前提，MMP若下降會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞即進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程［10］。在乙酸、兩性霉素B等誘導(dǎo)下，細(xì)胞可通過(guò)線粒體途徑而進(jìn)入凋亡過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的MMP結(jié)果顯示，黃芩苷作用于白念珠菌細(xì)胞后，MMP隨藥物濃度遞增而呈下降趨勢(shì)，提示黃芩苷可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞凋亡?；钚匝?(ROS)是真核細(xì)胞有氧呼吸過(guò)程中形成的一組化學(xué)性質(zhì)活潑的具有含氧基團(tuán)的化合物，且與MMP密切相關(guān)。ROS過(guò)多累積會(huì)損傷核酸、蛋白質(zhì)和磷脂膜等重要細(xì)胞組分，并可降低MMP，從而誘導(dǎo)凋亡［11］。本實(shí)驗(yàn)顯示，隨著黃芩苷濃度增高，白念珠菌細(xì)胞產(chǎn)生的ROS也逐漸增多，提示一定濃度的黃芩苷可能促進(jìn)ROS的產(chǎn)生進(jìn)而誘發(fā)凋亡。

從天然產(chǎn)物中尋找具有抗真菌活性的天然有效成分并深入闡明其作用機(jī)制，進(jìn)一步將其開(kāi)發(fā)應(yīng)用已成為抗真菌新藥研究的重要方向。本研究表明，中藥有效成分黃芩苷可以通過(guò)線粒體途徑即降低MMP和促進(jìn)ROS累積而誘導(dǎo)白念珠菌凋亡。近期國(guó)內(nèi)姜遠(yuǎn)英課題組發(fā)現(xiàn)黃芩的另一有效成分黃芩素(baicalein)也可通過(guò)誘導(dǎo)白念珠菌凋亡抑制其生長(zhǎng)［12-13］，黃芩苷與黃芩素均可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡方式抗白念珠菌，不僅有助于闡明黃芩及其有效成分抗真菌的作用機(jī)制，亦為其臨床防治白念珠菌感染提供重要依據(jù)。

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