郭毅，孔繁明，趙楠

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽 110001；2.遼寧省寬甸縣中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 寬甸 118200）

EB病毒是第1個被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤病毒，與多種淋巴細(xì)胞增殖性疾病的發(fā)生相關(guān)。在體外，EB病毒可將靜止的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有無限增殖能力的潛伏感染的B細(xì)胞，即淋巴母細(xì)胞樣B細(xì)胞系。此過程的關(guān)鍵調(diào)控因子包括EB病毒核抗原（Epstein-Barr nuclear antigen，EBNA）2、EBNA3A、EBNA3C 和LMP1 蛋白［1，2］。EBNA3C 作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子能夠與多種細(xì)胞及病毒因子相互作用。Gemin3是EBNA2、EBNA3C 及運(yùn)動神經(jīng)元生存因子的結(jié)合蛋白［3，4］，屬于DExD/H框RNA解旋酶家族，在RNA代謝過程中起重要作用［5，6］。Gemin3還可結(jié)合并調(diào)控多種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子［7～11］。我們的前期研究結(jié)果顯示：Gemin3可抑制p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和凋亡途徑，提示腫瘤病毒可能通過調(diào)控Gemin3靶基因的表達(dá)而抑制宿主細(xì)胞的凋亡。因此，本研究擬通過慢病毒載體介導(dǎo)發(fā)卡RNA干涉敲減EBNA3C基因的表達(dá)，探討EBNA3C與Gemin3的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

pA3F-EBNA3C質(zhì)粒表達(dá)EBNA3C全長，羧基端由Flag標(biāo)記。HEK293為經(jīng)腺病毒DNA轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞系，LCL1和LCL2為體外轉(zhuǎn)化的EBV陽性細(xì)胞系，表達(dá)EBNA3C的細(xì)胞系（BJAB7 and BJAB10）由pZipneo真核細(xì)胞表達(dá)載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染EBNA3CcDNA，并經(jīng)過新霉素選擇建立，以上質(zhì)粒及細(xì)胞系均由賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院Erle Robertson教授饋贈。鼠抗Gemin3單抗由賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院Gideon Dreyfuss惠贈，鼠抗Flag單克隆抗體M2購自Sigma-Aldrich公司，鼠抗EBNA3C單抗A10來自雜交瘤。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HEK 293細(xì)胞采用 DMEM（Hy－Clone公司）培養(yǎng)基培養(yǎng)，BJAB，RAMOS和EBV陽性的細(xì)胞系采用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別加入10%胎牛血清，50 U/mL青霉素，50 μg/mL鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺。在37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2 轉(zhuǎn)染：采用Bio-Rad Gene PulserⅡ型電穿孔儀瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。收集對數(shù)生長期細(xì)胞（1.5×107個），PBS沖洗，懸浮于 400 μL已加入待轉(zhuǎn)染EBNA3C質(zhì)粒的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入0.4 cm間距電轉(zhuǎn)杯中，電容為 975 μF，轉(zhuǎn)染 HEK 293和 SAOS-2電壓為210 V，B淋巴細(xì)胞為220 V。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞移至加入10 mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 Western blot：收集細(xì)胞，PBS洗滌，0.5 mL冰冷RIPA緩沖液裂解，加入蛋白酶抑制劑，21 000g（10 min、4℃）離心，上清轉(zhuǎn)移至新的微小離心管。用Laemmli上樣緩沖液加熱變性蛋白裂解物和免疫沉淀復(fù)合物，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜。用相關(guān)抗體檢測醋酸纖維膜中的蛋白，再與相應(yīng)的發(fā)射紅外光的第2抗體共培育后，用Odyssey imager（LiCor Inc.，Lincoln，NE）掃描。

1.2.4 慢病毒shRNA載體的構(gòu)建：將EBNA3C shRNA（CCATATACCGCAAGGAATA）插入 pGIPZ載體，按說明書（Open Biosystem公司）進(jìn)行操作，表達(dá)EBNA3C小發(fā)卡狀RNA的質(zhì)?？s寫為sh-E3C。此外，選取與已知人mRNA無同源性的21個寡核苷酸序列插入相同載體作為對照，縮寫為sh-C。

1.2.5 病毒的產(chǎn)生及感染B細(xì)胞：通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒。將HEK 293T細(xì)胞（2×106個）培養(yǎng)于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，采用添加10%FBS和1%抗菌防霉溶液的DMEM培養(yǎng)基，5%CO2培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染。每個培養(yǎng)皿中加入需轉(zhuǎn)染的20 μg DNA 質(zhì)粒（包括 1.5 μg包膜質(zhì)粒 pCMV-VSVG，3 μg包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒 pRSV-REV，5 μg包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒 pMDLg/Prre，10.5 μg的慢病毒載體質(zhì)粒）。采用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞：上述質(zhì)粒加蒸餾水共 438 μL 、2 mol/L Cacl262 μL 以及 2×HEPES 緩沖鹽水液500 μL，室溫放置30 min；轉(zhuǎn)染前5 min加入氯喹使終濃度為25 μmol/L；12 h后用含有10%FBS、10 mmol/L HEPES及 10 mmol/L丁酸鈉的DMEM更換培養(yǎng)液，10 h后用含有10%FBS和10 mmol/L HEPES的DMEM再次更換培養(yǎng)基。每隔12 h收集1次調(diào)整培養(yǎng)基，共4次，用0.45 μm孔徑醋酸纖維素膜過濾后凍存，最后以70 000g離心2.5 h收集病毒。用RPMI重新懸浮病毒，加入20 μmol/mL聚凝胺后，感染細(xì)胞（1×106）。72 h后加入嘌呤霉素使終濃度達(dá)到2 μg/mL以篩選感染的細(xì)胞。采用Olympus IX71熒光顯微鏡在560 nm激發(fā)并645 nm發(fā)射濾過條件下檢測綠色熒光蛋白。在2 μg/mL嘌呤霉素條件下，見細(xì)胞團(tuán)飽和度達(dá)到80%時(shí)，收集細(xì)胞做Western blot檢測。

2 結(jié)果

2.1 EBNA3C轉(zhuǎn)染導(dǎo)致Gemin3表達(dá)增加

為了研究EBNA3C或EBV對Gemin3蛋白表達(dá)的影響，我們對Gemin3蛋白在不同細(xì)胞中的表達(dá)做了定量分析，結(jié)果顯示：與對照細(xì)胞相比，EBNA3C和EBV陽性細(xì)胞系中Gemin3蛋白表達(dá)量明顯增高（圖 1，圖 2）。

為確定Gemin3表達(dá)的增加是由于EBNA3C作用的結(jié)果，我們用EBNA3C質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞并檢測Gemin3蛋白量，發(fā)現(xiàn)Gemin3蛋白表達(dá)水平隨著EBNA3C轉(zhuǎn)染量的增加而升高（圖3）。

我們通過慢病毒介導(dǎo)shRNA敲減EBNA3C及EBV陽性細(xì)胞內(nèi)EBNA3C基因的表達(dá)，經(jīng)過篩選獲明顯降低（圖4）。用Olympus IX71熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白為慢病毒轉(zhuǎn)染成功的指示蛋白，結(jié)果與Western blot一致（圖5）。得穩(wěn)定的攜帶sh-EBNA3C及對照的細(xì)胞系，采用Western blot檢測并比較EBNA3C敲減細(xì)胞與對照細(xì)胞中Gemin3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與對照細(xì)胞相比，EBNA3C敲減細(xì)胞中Gemin3表達(dá)水平

3 討論

EBNA3C蛋白由992個氨基酸組成，呈顆粒狀散在于細(xì)胞核內(nèi)，并具有多種功能：與RBP-Jκ形成穩(wěn)定的復(fù)合物并抑制后者與DNA結(jié)合，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用［12，13］；與活化的（Ha-）ras基因共同作用轉(zhuǎn)化大鼠的胚胎纖維母細(xì)胞，具有癌基因的功能［14］；通過蛋白之間直接相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，通過召集泛素化連接酶E3復(fù)合物機(jī)制降解Rb或p27蛋白［15，16］；穩(wěn)定宿主細(xì)胞內(nèi)的癌蛋白，如c-Myc和Mdm2［17，18］。

Gemin3最初是在尋找與EBNA2及EBNA3C相互作用的細(xì)胞因子的過程中通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的［4］。無論是對于果蠅還是哺乳動物，Gemin3都是胚胎發(fā)育和成活的關(guān)鍵基因［19，20］。Gemin3 通過與其他分子作用而表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能：與類固醇生長因子1（SF-1）結(jié)合并在轉(zhuǎn)錄水平抑制后者的功能［7］；與有絲分裂元Ets轉(zhuǎn)錄抑制因子METS/PE1或ERF形成復(fù)合物，通過召集組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶控制細(xì)胞的增殖和分化［11，21］；通過與早期生長反應(yīng)因子2結(jié)合并部分依賴召集HDAC而抑制其轉(zhuǎn)錄活性［9］；通過與叉頭轉(zhuǎn)錄因子2結(jié)合誘導(dǎo)凋亡［10］。Gemin3與腫瘤相關(guān)的直接證據(jù)來源于膀胱癌危險(xiǎn)因素與microRNA相關(guān)基因突變關(guān)系的臨床分析，Gemin3基因的非同義單核苷酸多態(tài)性的同源性變異是膀胱癌發(fā)病的高危因素［22］。Gemin3具有抑制p53基因轉(zhuǎn)錄的功能，慢病毒介導(dǎo)shRNA敲減Gemin3并經(jīng)過篩選的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞檢測顯示凋亡增加［23］。

本研究通過共轉(zhuǎn)染EBNA3C和Gemin3基因至HEK293細(xì)胞，依靠慢病毒載體介導(dǎo)發(fā)卡RNA干涉敲減EBNA3C基因的表達(dá)，并經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定的EBNA3C低表達(dá)細(xì)胞系，采用Western blot及熒光顯微鏡檢測了EBNA3C對Gemin3蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明EBNA3C能夠上調(diào)具有癌蛋白功能的Gemin3表達(dá)水平。今后我們將在轉(zhuǎn)錄及蛋白修飾水平對其可能的調(diào)控機(jī)制開展進(jìn)一步的研究。

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