朱天輝，李姝江，韓 珊，譙天敏

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 雅安 625014)

撐×綠雜交竹是以撐蒿竹為母本(Bambusa pervaiabilis Mc-Clure)，大綠竹(Dendrocalamopsis daii Keng f.)為父本，通過(guò)人工授粉，經(jīng)過(guò)多年研究而培育篩選出的新竹種，1993年被列為林業(yè)部(局)100項(xiàng)重點(diǎn)成果推廣之一。南方地區(qū)已大量栽培，特別在長(zhǎng)江中上游地區(qū)生態(tài)建設(shè)中，四川于1999年從廣西大規(guī)模引種該竹以滿(mǎn)足造紙業(yè)和退耕還林的需求。但近年來(lái)雜交竹出現(xiàn)大面積枯死，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，極大地威脅著長(zhǎng)江中上游地區(qū)退耕還林的進(jìn)程和生態(tài)屏障的建設(shè)，目前已證實(shí)導(dǎo)致雜交竹枯死的病原為暗孢節(jié)菱孢菌［Arthrinium phaeospermum(Corda)M.B.Ellis］［1］，其產(chǎn)生的毒素是病害發(fā)生的主要致病因子，該毒素由蛋白類(lèi)［2］和非蛋類(lèi)［3］物質(zhì)組成，其毒理作用作者已進(jìn)行了深入探索，但對(duì)毒素物質(zhì)的快速檢測(cè)尚無(wú)研究。本文在純化雜交竹梢枯病菌蛋白毒素基礎(chǔ)上，用A蛋白雙抗夾心法對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記試驗(yàn)，為該毒素結(jié)合位點(diǎn)研究提供檢驗(yàn)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病株汁液:發(fā)病雜交竹榨取液。

毒素發(fā)酵液:以改進(jìn)Fries為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，定量接種在PDA平板上培養(yǎng)的暗孢節(jié)菱孢菌絲塊(5 mm·100 mL－1)，26 °C，140 r·min－1震蕩培養(yǎng) 15 d，雙層紗布過(guò)濾后，取其濾液備用。

毒素蛋白及其抗血清:上述毒素發(fā)酵液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(40℃)濃縮、硫酸銨分級(jí)沉淀［4］，結(jié)合低壓層析分離系統(tǒng)［5］和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳［6］方法純化獲得純蛋白組分(毒素)，采用常規(guī)方法免疫新西蘭大白兔［7］，即經(jīng)兩次基礎(chǔ)免疫［背部皮下、皮內(nèi)多點(diǎn)注射2 mL乳劑(含0.5 mL 30 μg·mL－1Ap-毒素蛋白)］和3次強(qiáng)化免疫(靜脈注射，用量同基礎(chǔ)免疫)后，頸動(dòng)脈采血，獲得毒素的抗血清。玻管環(huán)狀沉淀測(cè)定其效價(jià)為1∶640。

1.2 酶聯(lián)免疫檢測(cè)

采用陳永萱［8］的A蛋白雙抗體夾心方法。試驗(yàn)在微量測(cè)定板的小孔內(nèi)進(jìn)行:(1)用0.05 mol·L－1pH 9.6的碳酸鹽緩沖液配制的A蛋白溶液預(yù)包被。每孔200 μL，處理2小時(shí)。(2)以0.05%的Tween20磷酸鹽緩沖液(0.01 mg·L－1pH7.0 PBST)稀釋的抗血清包被小孔，每孔加100 μL，處理1 h。(3)加測(cè)定樣本(雜交竹梢枯病株汁液、純蛋白毒素、毒素發(fā)酵液)，以PBST稀釋?zhuān)靠准?00 μL處理2 h。(4)加測(cè)定血清，以PBST稀釋?zhuān)靠?00 μL，處理2 h。(5)加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的葡萄球A蛋白(HRP-Protein A是上海生物制品研究所產(chǎn)品)。HRP-Protein A同樣以PBST稀釋?zhuān)靠准?00 μL，處理1 h。(6)加底物 TMB顯色30 min。底物以22.2 mL的0.1 mol·L－1檸檬加27.8 mL的0.2 mol·L－1磷酸氫二鈉加蒸餾水至100 mL的緩沖液稀釋?zhuān)靠?00 μL。(7)以2 M的H2SO4終止反應(yīng)，每孔加50 μL。然后在酶標(biāo)免疫檢測(cè)儀上(A450 nm)記錄讀數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和LSD多重差異比較(p＜0.05)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 A蛋白預(yù)包被對(duì)檢測(cè)效果的影響

表1表明A蛋白預(yù)包被能影響ELISA測(cè)定結(jié)果，A蛋白預(yù)包被不僅能提高測(cè)定的效價(jià)特別是在測(cè)定抗血清稀釋度較高的情況下更為顯著，而且也能明顯降低無(wú)蛋白毒素對(duì)照本底值。凡不加A蛋白預(yù)包被時(shí)的本底值在0.40～0.42之間，而加A蛋白預(yù)包被的本底值卻降到0.07～0.08，與緩沖液作對(duì)照的數(shù)值接近。A蛋白預(yù)包被適宜濃度的測(cè)定是將 A 蛋白從 10 μg·mL－1稀釋至 0.001 μg·mL－1分別預(yù)包被微量測(cè)定板，對(duì)暗孢節(jié)菱孢發(fā)酵液進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定的OD值隨A蛋白的稀釋而有下降趨勢(shì)，但在測(cè)定的A蛋白預(yù)包被的濃度范圍內(nèi)沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明A蛋白預(yù)包被可以在很微量的濃度下進(jìn)行測(cè)定，即使稀釋到0.001 μg·mL－1仍有較好的檢測(cè)效果。

2.2 抗原(純毒素和發(fā)酵液、病株汁液)濃度對(duì)酶聯(lián)檢測(cè)的作用

將純毒素蛋白經(jīng)10倍系列稀釋至10－10后進(jìn)行靈敏度和特異性測(cè)定顯示(表2)，提純毒素在稀釋倍數(shù)小于10－4時(shí)，檢測(cè)結(jié)果顯著，而當(dāng)稀釋倍數(shù)大于10－6，檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照接近，不適宜進(jìn)行測(cè)定。

表1 A蛋白預(yù)包被對(duì)檢測(cè)效果的影響(OD450吸收值)Table 1 Effect of protein's pre-coating on the detection(OD450absorption)

表2 純毒素蛋白濃度對(duì)檢測(cè)的影響Table 2 Effect of the concentration of purified toxic protein on the detection

將含毒素發(fā)酵液和病株汁液稀釋不同倍數(shù)在相同條件下檢測(cè)，兩種含毒素材料測(cè)定趨勢(shì)相似，OD值隨抗原稀釋倍數(shù)的增加下降，且下降幅度受測(cè)定抗血清濃度的影響(表3和表4)。如測(cè)定抗血清濃度為10－3時(shí)，病株汁液稀釋到100倍時(shí)就不能進(jìn)行測(cè)定比較，而測(cè)定抗血清濃度為10－2時(shí)，病株汁液稀釋至1000倍以上時(shí)才不能檢測(cè)。

表3 發(fā)酵液濃度對(duì)檢測(cè)的影響Table 3 Effect of the concentration of fermentation liquid on the detection

表4 病株汁液濃度對(duì)檢測(cè)的影響Table 4 Effect of the concentration of the juice of diseased plant on the detection

2.3 抗血清濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

在相同測(cè)定條件下比較，含毒素發(fā)酵液和病株汁液檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)相似，OD值隨測(cè)定抗血清濃度降低而下降，同時(shí)，抗原濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果也有較大影響(表5和表6)。兩種被檢測(cè)液稀釋1∶100倍，10－3的測(cè)定抗血清濃度的OD值與健株差異不明顯，當(dāng)檢測(cè)液稀釋1∶5(1∶50時(shí)，測(cè)定抗血清濃度在10－4(病株汁液)和10－6(含毒素發(fā)酵液)時(shí)可測(cè)出顯著差別。

2.4 標(biāo)記A蛋白濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

結(jié)果表明(表7)，標(biāo)記A蛋白濃度對(duì)檢測(cè)有顯著影響，OD值隨酶標(biāo)記A蛋白濃度而下降，抗血清濃度為10－4下，含毒素發(fā)酵液在標(biāo)記A蛋白濃度為1∶10(1∶640范圍內(nèi)有較好測(cè)定結(jié)果，而病株汁液在標(biāo)記A蛋白濃度為1∶10(1∶160才能測(cè)出。

表5 抗血清與毒素發(fā)酵液稀釋度的關(guān)系Table 5 Relationship between antiserum and dilution multiple of toxic fermentation liquid

表6 抗血清與病株汁液稀釋度的關(guān)系Table 6 Relationship between antiserum and dilution multiple of diseased plant juice

表7 酶標(biāo)記A蛋白濃度對(duì)檢波靈敏度的影響Table 7 Effect of protein A on demodulation sensitivity

3 討論

雜交竹梢枯病是四川近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的重大毀滅性病害，發(fā)病迅速，防治難度大，如不早期發(fā)現(xiàn)，很難控制。A蛋白間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)雜交竹梢枯病菌毒素蛋白是在雙抗體夾心直接免疫吸附法［8］基礎(chǔ)上進(jìn)行的，后者已廣泛應(yīng)用于植物病毒的檢測(cè)工作，本研究首次將此技術(shù)用于真菌毒素檢測(cè)中，該方法對(duì)雜交竹病株汁液中的致病毒素有高度的特異性和靈敏度，能早期診斷暗孢節(jié)菱孢引起的雜交竹梢枯病，對(duì)雜交竹養(yǎng)護(hù)有重要意義。

A蛋白預(yù)包被對(duì)本底值下降和非特異性反應(yīng)的消除有明顯作用，可大大提高測(cè)定效價(jià);在測(cè)定中，預(yù)包被的A蛋白只需要很微的量，測(cè)定抗血清的濃度對(duì)包被抗血清的濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響更為重要，提高抗血清的效價(jià)進(jìn)而提高測(cè)定的靈敏度。

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