蔣玉蘭王 彬*毛 銀,2左 茜,2

（1.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫 214000）

茶多酚對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響

蔣玉蘭1王 彬1*毛 銀1,2左 茜1,2

（1.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫 214000）

本文通過(guò)測(cè)定脫脂乳培養(yǎng)基中保加利亞乳桿菌菌體數(shù)目變化及產(chǎn)酸能力變化，研究茶多酚對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，高含量茶多酚對(duì)保加利亞乳桿菌酸牛乳發(fā)酵具有明顯的抑制作用，低含量茶多酚抑制作用較小。隨著茶多酚濃度的增加，相同發(fā)酵時(shí)間的菌體數(shù)目先增大后減小，當(dāng)茶多酚添加量為2.0g/L的時(shí)候，菌體數(shù)目最多；茶多酚濃度相同時(shí)，隨發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，酸牛乳的酸度逐漸增大，到發(fā)酵后期酸度趨于穩(wěn)定，當(dāng)茶多酚添加量為2.0g/L時(shí)，最終酸度最大；發(fā)酵后期，菌體形態(tài)極不穩(wěn)定，大量保加利亞乳桿菌衰亡。茶多酚添加量過(guò)多，保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸能力下降。而且茶多酚的顏色影響酸牛乳的色澤。

茶多酚 保加利亞乳桿菌 綠茶酸牛乳

目前，酸奶堪稱(chēng)最適合于人類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)保健品。眾所周知，茶含有多種功能成分，在酸牛乳制品中添加茶粉，有利于提升產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效，同時(shí)茶多酚、茶氨酸等風(fēng)味物質(zhì)賦予產(chǎn)品全新的口感風(fēng)味，改善了傳統(tǒng)產(chǎn)品的物理性狀，豐富了酸牛乳市場(chǎng)的產(chǎn)品體系，滿(mǎn)足了不同消費(fèi)群體對(duì)高品質(zhì)產(chǎn)品的消費(fèi)訴求。綠茶酸奶的開(kāi)發(fā)，可為營(yíng)養(yǎng)豐富的酸奶引入植物營(yíng)養(yǎng)源，完善其營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，拓寬茶葉市場(chǎng)，同時(shí)形成清新怡人的茶風(fēng)味酸奶[1]。本研究將為綠茶酸奶的開(kāi)發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

茶多酚（純度99%），由中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社杭州茶葉研究院食品技術(shù)研究所提供；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus），由江南大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；光明脫脂乳粉，購(gòu)于杭州聯(lián)華超市外海店。所用藥品試劑均為分析純。

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AL-204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電子顯微鏡，OLYMPUS BH-2，JAPAN；醫(yī)用凈化工作臺(tái)YJ-875，蘇州凈化設(shè)備公司；生化培養(yǎng)箱SPX-150B-2型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，浙江省玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌菌種的分離與純化

利用MRS固體培養(yǎng)基，采用平板涂布法對(duì)保加利亞乳桿菌進(jìn)行分離純化。

1.2.2 保加利亞乳桿菌菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

將純化后的保加利亞乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，40℃條件下恒溫培養(yǎng)24h，所得菌懸液備用。

1.2.3 茶多酚對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響

配置8%（m/m）的脫脂乳溶液，分別按0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0g/L的茶多酚添加比例向脫脂乳溶液中添加茶多酚，115℃滅菌8min，備用。按3%(v/v)的比例將保加利亞乳桿菌菌懸液接種于脫脂乳培養(yǎng)液中，40℃條件下恒溫連續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)4、6、8、10、12、14和16h時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中菌體個(gè)數(shù)、酸度，并觀察培養(yǎng)液中菌體形態(tài)。

1.2.4 保加利亞乳桿菌菌體形態(tài)變化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)初期保加利亞乳桿菌菌體變大、數(shù)目變化較小、培養(yǎng)液酸度基本不變。本研究我們忽略培養(yǎng)初期（即調(diào)整期）菌體個(gè)數(shù)和培養(yǎng)液酸度的變化，只觀察菌體形態(tài)。采用革蘭氏染色鏡檢的方法觀察保加利亞乳桿菌的菌體形態(tài)，拍攝照片并描述。

1.2.5 保加利亞乳桿菌計(jì)數(shù)

運(yùn)用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)[2]。視待測(cè)菌懸液濃度，加無(wú)菌水適當(dāng)稀釋?zhuān)悦啃「竦木鷶?shù)個(gè)數(shù)為度(每小格個(gè)數(shù)≤5）。計(jì)數(shù)區(qū)是由25個(gè)大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)，數(shù)左上、左下、右上、右下和中央1個(gè)大方格的菌數(shù)（即80個(gè)小格）。

計(jì)數(shù)公式（16格×25格的血球計(jì)數(shù)板）：

細(xì)胞數(shù)/mL=100小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/100×400× 10000×稀釋倍數(shù)

1.2.6 培養(yǎng)基酸度變化

利用NaOH滴定法測(cè)定培養(yǎng)基的酸度[3]。培養(yǎng)基酸度的測(cè)定采用混合指示劑滴定法測(cè)定。用混合指示劑（百里酚藍(lán)-酚酞作指示劑）滴定法。（滴定酸度終點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)顏色液的制備：取酸牛乳5.00g，置于150mL錐形瓶中，加40mL新煮沸放冷至40℃的水，混勻，再加入3滴0.125g/L的堿性品紅溶液搖勻后，即為該樣品滴定酸度終點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)顏色液。）

2 結(jié)果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌菌體形態(tài)變化

將保加利亞乳桿菌按3%的比例接種于含有不同質(zhì)量茶多酚的無(wú)菌脫脂乳培養(yǎng)基（1.2.3）中，隨培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)行，菌體形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。本實(shí)驗(yàn)基于不同茶多酚添加量的培養(yǎng)基中，菌體形態(tài)變化大致相同?，F(xiàn)僅以茶多酚添加量為2.0g/ L的培養(yǎng)基為例進(jìn)行說(shuō)明。在培養(yǎng)調(diào)整初期，菌體物質(zhì)增加，菌體生長(zhǎng)而不分裂。在調(diào)整期末期（圖1A），菌體代謝活動(dòng)能力強(qiáng)，開(kāi)始細(xì)胞分裂，出現(xiàn)個(gè)體小的菌體。對(duì)數(shù)期（圖1B）的菌體以幾何數(shù)增加，增長(zhǎng)速度快，菌體很少死亡或不死亡，此時(shí)菌體大小仍不均一，但個(gè)體小的菌體數(shù)量急劇增多。穩(wěn)定期（圖1C）菌體生長(zhǎng)速率下降，死亡率上升，細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，新生菌體數(shù)和死亡菌體數(shù)相當(dāng)，此時(shí)菌體形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定。衰亡期菌體死亡率增加，菌體少繁殖或不繁殖，菌體出現(xiàn)多形態(tài)、畸形或衰退型（圖1D）。

2.2 保加利亞乳桿菌菌體數(shù)目變化

由表1可以看出，隨著茶多酚濃度的增加，相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，溶液中菌體數(shù)目先增多后減少，這是由于低含量茶多酚能夠促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)，而高含量茶多酚則抑制乳酸菌生長(zhǎng)[4]。當(dāng)茶多酚添加量為2.0g/L的時(shí)候，菌體數(shù)目增長(zhǎng)最快，培養(yǎng)14h時(shí)的菌體數(shù)目達(dá)到最大值4.22×109。當(dāng)茶多酚添加量相同時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的菌體數(shù)目大致呈上升趨勢(shì)。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間保加利亞乳桿菌的菌體形態(tài)變化注：A:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；B：穩(wěn)定期；C：穩(wěn)定期后期；D：衰亡期Fig.1 The morphology of the Lactobacillus bulgaricus during different culture timeNote:A:Late adjustment phase;B:Log phase;C:Stationary phase D:Decline phase

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間和茶多酚濃度的培養(yǎng)基中的保加利亞乳桿菌數(shù)目Table1 The number of the Lactobacillus bulgaricus in milk medium as tea polyphenols content and culture time change

2.3 培養(yǎng)基酸度變化

茶多酚的添加，對(duì)保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸能力的影響較大。一般酸牛乳發(fā)酵，最后的酸度可達(dá)80～100T0左右[3]，而本研究添加茶多酚以后，保加利亞乳桿菌脫脂乳培養(yǎng)基的酸度最大才為48.3T0。究其原因，可能是因?yàn)槭惺鬯崤Ｈ榈陌l(fā)酵劑為混合發(fā)酵劑，如同時(shí)包含保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，混合發(fā)酵劑中菌種的生理活性的協(xié)同作用使得最終酸牛乳產(chǎn)品的酸度較大。已有研究表明，多酚的活性在豆奶發(fā)酵過(guò)程中不受影響[5]。隨發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，酸牛乳的酸度逐漸增大，到發(fā)酵后期酸度趨于穩(wěn)定，從表2可以看出，當(dāng)茶多酚添加量為2.0g/L的時(shí)候，抑制效果相對(duì)較小，培養(yǎng)基最終酸度最大。另外，因?yàn)椴瓒喾訛樽丶t色粉末，所以茶多酚的添加，在一定程度上影響了酸牛乳的色澤，所以生產(chǎn)上建議采用低濃度的茶多酚添加量。多酚含量占茶葉干重的20%～30%，綠茶酸牛乳的實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中亦應(yīng)控制好綠茶粉的添加量。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間不同茶多酚濃度的培養(yǎng)基的酸度變化Table2 The medium acidity of culture as different tea polyphenols content and different culture time

3 結(jié)論與展望

高含量茶多酚對(duì)保加利亞乳桿菌酸牛乳發(fā)酵具有明顯的抑制作用。尤其在發(fā)酵后期，菌體形態(tài)極不穩(wěn)定，大量保加利亞乳桿菌乳桿菌衰亡。當(dāng)茶多酚添加量為2.0g/L的時(shí)候，抑制效果相對(duì)較小，此時(shí)菌體產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，酸牛乳的感官品質(zhì)較佳，脫脂乳培養(yǎng)基中保加利亞乳桿菌數(shù)量最多。茶多酚等物質(zhì)在乳制品中可以很好的保持其原有的活性，依然具有很多保健功能[6]。當(dāng)茶多酚添加量過(guò)多時(shí)，大大抑制了保加利亞乳桿菌的活性，使其產(chǎn)酸能力下降，而且茶多酚的顏色影響了酸牛乳產(chǎn)品的色澤，建議生產(chǎn)采用≤2.0g/L的茶多酚添加量。

綜上，綠茶酸奶產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)仍面臨很多問(wèn)題，后續(xù)工作應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)茶多酚對(duì)乳酸菌影響的研究。篩選出最適合乳酸菌生長(zhǎng)的綠茶粉添加量及最優(yōu)綠茶酸牛乳發(fā)酵的發(fā)酵劑組合。為綠茶酸牛乳產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與產(chǎn)品市場(chǎng)化打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，為農(nóng)民增收創(chuàng)益。

[1] 孫卉子,朱科學(xué),朱躍進(jìn),等.酸奶發(fā)酵對(duì)綠茶粉功效成分和抗氧化性的影響[J].食品工業(yè)科技,2011,32(9):131-33.

[2] Jay M J,徐巖,張繼民,等.現(xiàn)代食品微生物學(xué)(第五版)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2001.

[3] 杜磊,張光杰.酸奶在儲(chǔ)藏過(guò)程中酸度、pH值、細(xì)菌的變化[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,32(2):73-75.

[4] 唐裕芳,張妙齡,馮波,等.茶多酚的抑菌活性研究[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào),2005,22(5):553-557.

[5] Patrick P,Mc Cue,Kalidas Shetty.Phenolic antioxidant mobilization during yogurt production from soymilk using kefir cultures[J].Process Biochemistry,2005(40):1791-1797.

[6] Coisson J D,Travaglia F,Piana G,et al.Euterpe oleracea juice as a functional pigment for yogurt[J].Food Research International, 2005(38):893-897.

Exploration Research on Effects of Tea Polyphenols on the Growth of Lactobacillus Bulgaricus

JIANG Yu-lan1,WANG Bin1*,MAO Yin1,2,ZUO Qian1,2

(1.Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China;2.Jiangnan University,Wuxi 214000,China)

The effects of tea polyphenols on the growth of Lactobacillus bulgaricus was studied by determining the number of bacterium and the acid-producing ability.The results show that the inhibiting effect of tea polyphenols on Lactobacillus bulgaricus grown in milk decreased as the contents of tea polyphenols decreasing.As the contents of tea polyphenols increase,the number of bacteria increases but then decreases at the same fermentation time,and the number of Lactobacillus bulgaricus reaches the largest at the content of tea polyphenols of 2.0 g/L.As the fermentation time increases,the acidity of milk increases gradually at the same content of tea polyphenols at the beginning,while it is going to be stable later.When the content of tea polyphenols is 2.0 g/L,the acidity is the highest.During the late fermentation period,the morphology of Lactobacillus bulgaricus is very unstable and a large of them decays.When the content of tea polyphenols is over high,the acid-producing ability of Lactobacillus bulgaricus is decreased and the color of yogurt is affected by the color of tea polyphenols.

Tea polyphenols,Lactobacillus bulgaricus,Green tea powder yoghurt

中國(guó)茶葉加工 2012，（2）45～48

2012-02-09

科研院所技術(shù)開(kāi)發(fā)研究專(zhuān)項(xiàng)資金（2010EG163313）；浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2110C32042）

蔣玉蘭（1982-），女，山東臨沂人，碩士，主要從事天然植物資源多元化利用方面的研究。

*通訊作者：wangbin_313@126.com