李勇 徐麗瑤 蔡阿橋 李麗芳 鐘小軍

放射治療是肺癌綜合治療的重要手段之一，如何減少放療抵抗、增加放療敏感性已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1]。低氧是肺癌等實(shí)體瘤微環(huán)境的基本特征，也是導(dǎo)致肺癌對(duì)放療產(chǎn)生抵抗的原因之一，低氧可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬的發(fā)生。近年研究[2,3]表明，自噬可增加乳腺癌、惡性腦膠質(zhì)瘤放療抵抗。然而低氧環(huán)境中自噬是否影響肺癌的放療治療效應(yīng)目前尚未完全明確。本研究通過(guò)觀察γ射線對(duì)低氧環(huán)境中不同自噬水平A549細(xì)胞的殺傷作用，初步分析保護(hù)性自噬對(duì)A549細(xì)胞放療敏感性的影響，為探討自噬對(duì)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）放療敏感性的影響的分子機(jī)制奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone）；蛋白提取試劑盒（Pierce公司）；MTT粉（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA，美國(guó)Sigma公司）；PCR儀（ABI公司）；三氣培養(yǎng)箱（SANYO公司）；蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad公司）；透射電子顯微鏡（日本JEM-2100）；直線加速器（西門(mén)子公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細(xì)胞（購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)），用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37oC、5%CO2/95%空氣（常氧）飽和濕度培養(yǎng)箱常規(guī)傳代培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的不同，分別接種于60 mm培養(yǎng)皿、6孔板及96孔板中培養(yǎng)12 h。更換新鮮培養(yǎng)基后置于37oC、1%O2/5%CO2/94%N2三氣培養(yǎng)箱中，繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 ①低氧對(duì)照組；②低氧+3-MA（5 mmol/L）組。

1.3 電鏡下觀察自噬體的變化 取接種于60 mm培養(yǎng)皿中的A549細(xì)胞，加入3-MA（5 mmol/L）處理后繼續(xù)低氧培養(yǎng)，分別于0 h，24 h，48 h用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，PBS洗3次，加入新配的4%多聚甲醛，4oC過(guò)夜。然后將細(xì)胞沉淀放入1%的四氧化鋨中，室溫固定1 h，經(jīng)一系列脫水及包埋后，固定于銅網(wǎng)上用電鏡觀察。

1.4 Western blot檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá) 取接種于6孔板中的A549細(xì)胞， 3-MA（5 mmol/L）處理后低氧培養(yǎng)，于48 h收集低氧組及低氧+3-MA組的細(xì)胞，冷PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液于4oC裂解20 min，12,000 r/min離心20 min，收集上清，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。取20 μg樣品煮沸變形后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37oC封閉2 h，一抗4oC孵育過(guò)夜，洗膜，二抗37oC孵育1 h，ECL法顯影，分析條帶灰度值，以目的條帶與β-actin調(diào)對(duì)灰度比值來(lái)表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的變化 取接種于96孔板中的A549細(xì)胞，加入3-MA處理24 h后給予分別給予0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT 20 μL，作用4 h，吸去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，震蕩10 min，于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)抑制率=（1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組）×100%，細(xì)胞相對(duì)存活率=1-相對(duì)抑制率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，采用t檢驗(yàn)分析組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3-MA對(duì)低氧狀態(tài)下A549細(xì)胞的自噬水平的影響 隨著低氧培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)（0 h、24 h、48 h），A549細(xì)胞中自噬體形成逐漸增加；給予自噬抑制劑3-MA后，A549細(xì)胞自噬體增殖明顯減少（圖1），表明3-MA可抑制低氧狀態(tài)下A549細(xì)胞的自噬活性。

2.2 3-MA對(duì)缺氧狀態(tài)下A549細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白LC3蛋白表達(dá)的影響 LC3有兩種存在形式（LC3I、LC3II），前體LC3合成后經(jīng)加工形成LC3I，后者與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3II。當(dāng)自噬形成時(shí)LC3I會(huì)減少而LC3II會(huì)增加。經(jīng)圖像半定量分析灰度值（圖2），低氧組+3-MA組和低氧組LC3-I/β-actin灰度比值分別為0.71±0.03和0.51±0.01，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LC3-II/β-actin灰度比值分別為0.42±0.02和0.86±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，與低氧組相比，低氧+3-MA組LC3II表達(dá)水平下調(diào)，LC3I表達(dá)水平上調(diào)，LC3II/LC3I比值下降，表明3-MA可有效抑制缺氧狀態(tài)下A549細(xì)胞的自噬標(biāo)記蛋白的表達(dá)。

2.3 低氧微環(huán)境下A549細(xì)胞自噬活性對(duì)放療敏感性的影響 低氧狀態(tài)下，放療+3-MA組中A549細(xì)胞增殖活性較單純放療組下降（P＜0.05）（表1），表明采用自噬抑制劑3-MA下調(diào)A549細(xì)胞自噬活性后，能增強(qiáng)A549細(xì)胞的放療敏感性。

3 討論

自噬是細(xì)胞為適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)或生長(zhǎng)因子缺乏、低氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等有害刺激所發(fā)生的一種應(yīng)激反應(yīng)[4]。在氧供不足或營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)自噬緩解細(xì)胞的代謝壓力，克服營(yíng)養(yǎng)缺乏和低氧環(huán)境得以生存[5]；同時(shí)，自噬可選擇性地清除某些細(xì)胞成分，如受損或多余的氧自由基、DNA、過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等，減少異常蛋白、細(xì)胞器的堆積，以維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)[6]。自噬作為一種防御機(jī)制，在應(yīng)激狀態(tài)下，特別是缺氧條件下對(duì)維持腫瘤細(xì)胞存活、逃避凋亡具有重要作用。

放射治療是腫瘤最重要的治療手段之一，然而卻因腫瘤的放療抵抗而易導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和殘留。研究發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的自噬水平可影響放療敏感性。Ito等[3]證實(shí)，與單純放療組相比，放療聯(lián)合自噬抑制劑（3-MA和巴佛洛霉素A）可明顯增加惡性腦膠質(zhì)瘤U373-MG細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷。Chaachouay等[2]則證實(shí)，與乳腺癌放療敏感細(xì)胞株HBL-100相比，乳腺癌放療抵抗細(xì)胞株MDA-MB-231自噬活性明顯增強(qiáng)，采用自噬抑制劑（3-MA和氯喹）預(yù)處理MDA-MB-231細(xì)胞，可明顯抑制其增殖活性，減少其放療抵抗。自噬與肺癌亦關(guān)系密切。Kim等[7]使用自噬抑制劑如caspase-3抑制劑（ZDEVD）和mTOR抑制劑（RAD001）能使NSCLC H460細(xì)胞增殖活性下降，凋亡增加，從而明顯增強(qiáng)H460細(xì)胞的放射敏感性，同時(shí)在小鼠荷瘤模型中觀察到，放療分別聯(lián)合Z-DEVD或RAD001，生存期較單純放療組分別延長(zhǎng)3 d和5 d 。

圖1 低氧狀態(tài)下3-MA處理后A549細(xì)胞自噬體的變化（×6,000）Fig 1 The change of autophagosome in A549 cells after treatment with 3-MA in hypoxia condition. A: hypoxia 0 h group； B: hypoxia 24 h group；C: hypoxia 48 h group； D: hypoxia plus 3-MA 0 h group； E:hypoxia plus 3-MA 24 h group；F: hypoxia plus 3-MA 48 h group.

圖2 低氧48 h后兩組A549細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白LC3的表達(dá)變化Fig 2 The expression changes of LC3 protein in A549 cells after hypoxia for 48 h

表1 低氧培養(yǎng)后不同放射劑量下自噬對(duì)A549細(xì)胞存活的影響Tab 1 The effect of autophagy on the viability of A549 cell after treatment with different radiotherapy doses in hypoxia condition

可見(jiàn)，自噬調(diào)節(jié)聯(lián)合放療有望成為腫瘤治療的新策略。但目前有關(guān)肺癌與自噬關(guān)系的研究，絕大多數(shù)局限于在常氧狀態(tài)下，而在低氧微環(huán)境中，自噬影響肺癌細(xì)胞放療敏感性的研究目前僅見(jiàn)零星報(bào)道。

由于肺癌等實(shí)體腫瘤在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞的快速生長(zhǎng)、氧耗增加，加之血管新生紊亂，腫瘤內(nèi)部常處于低氧狀態(tài)。低氧可增加放療抵抗而使腫瘤更具有侵襲性[8]，但其具體機(jī)制未明。研究表明低氧可誘發(fā)細(xì)胞自噬的發(fā)生。為了更好地模擬腫瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)微環(huán)境，探討自噬對(duì)低氧微環(huán)境中人肺腺癌A549細(xì)胞放療敏感性的影響，課題組建立了低氧培養(yǎng)條件，采用肺腺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察不同自噬活性下A549細(xì)胞對(duì)放療射線的敏感性。

本研究通過(guò)觀察自噬體的數(shù)量及檢測(cè)LC3的表達(dá)、分析LC3II/LC3I比值變化來(lái)判斷細(xì)胞的自噬活性。LC3蛋白是自噬體膜上標(biāo)志性蛋白，是反映自噬活性較特異的指標(biāo)。研究[9]報(bào)道，5 mmol/L 3-MA可抑制常氧環(huán)境中胃癌BGC-823細(xì)胞自噬水平，本研究證實(shí)給予3-MA（5 mmol/L）處理后，低氧環(huán)境中A549細(xì)胞自噬體數(shù)量減少，LC3II/LC3I比值下降，這表明3-MA（5 mmol/L）亦可成功抑制低氧環(huán)境中A549細(xì)胞自噬的發(fā)生。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在不同劑量放療照射同時(shí)給予3-MA處理A549細(xì)胞，細(xì)胞相對(duì)存活率較單純放療組均有不同程度的下降。表明采用3-MA抑制自噬可增強(qiáng)A549細(xì)胞放療敏感性，但其具體分子機(jī)制尚不明確，分析可能與3-MA通過(guò)抑制bcl-2表達(dá)使腫瘤細(xì)胞凋亡增加以及3-MA通過(guò)抑制PI3K/AKT途徑進(jìn)而阻斷COX2誘導(dǎo)的凋亡抵抗[10]有關(guān)，尚有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

文獻(xiàn)[11]報(bào)道，3-MA可影響腫瘤細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性 。本實(shí)驗(yàn)未放療組（0 Gy組）結(jié)果顯示，3-MA（5 mmol/L）處理細(xì)胞后其相對(duì)存活率較對(duì)照組呈下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮本實(shí)驗(yàn)單一劑量3-MA并未完全反映其對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。本研究選用3-MA（5 mmol/L）在有效抑制細(xì)胞自噬的同時(shí)，其對(duì)細(xì)胞增殖影響甚微，表明3-MA對(duì)A549細(xì)胞的放療增敏作用是通過(guò)抑制細(xì)胞自噬水平實(shí)現(xiàn)的。此外，不同濃度3-MA對(duì)A549細(xì)胞自噬及放療敏感性是否有影響，尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。本研究結(jié)果為后期探討自噬對(duì)NSCLC放療敏感性的作用的分子機(jī)制奠定了前期基礎(chǔ)。