孟曉林，劉梅，王寶杰，蔣克勇，田雪，王雷

（1．中國科學(xué)院 海洋研究所，山東 青島266071；2．中國科學(xué)院 研究生院，北京100049；3．山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801）

蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）隸屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca）瓣鰓綱（Lamellibranchiata），珍珠貝目（Pterioida），扇貝科（Pectinidae），是中國北部重要的海水養(yǎng)殖品種。到2005年，年產(chǎn)量已達(dá)到15萬噸。近些年來，由于夏季環(huán)境高溫、氣候變化以及人類活動(dòng)，沿海水體相關(guān)的環(huán)境因子已經(jīng)發(fā)生了極大的變化，并且對(duì)蝦夷扇貝養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損害［1］。

重金屬是對(duì)生態(tài)環(huán)境造成極大危害的污染物，具有來源廣、殘毒時(shí)間長(zhǎng)、易蓄積、污染后不易被發(fā)現(xiàn)且難于恢復(fù)等特征，并且對(duì)無脊椎動(dòng)物具有極大的毒性［2］。其中鎘（Cadmium，Cd）是目前我國渤海灣海域污染比較嚴(yán)重的重金屬［3］，因此研究其在蝦夷扇貝體組織的蓄積規(guī)律和毒性作用具有重要意義。谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）是一種重要的內(nèi)源性抗氧化蛋白并且廣泛分布于耗氧的生物體組織中，它通過催化過氧化氫還原為水調(diào)節(jié)組織的抗氧化防御反應(yīng)［3］。谷胱 甘 肽 硫 轉(zhuǎn) 移 酶 （Glutathione S－transferases，GSTs）是谷胱甘肽復(fù)合物解毒酶家族中的重要組成部分，它可增加異源物質(zhì)的可溶性并使其從細(xì)胞中排出［4］。由于GPx、GST在解毒和抗氧化防御中的重要作用，已有研究將其作為環(huán)境監(jiān)控生物標(biāo)志物［5］，但對(duì)于在重金屬作用下機(jī)體相關(guān)酶活性的變化還存在誘導(dǎo)或抑制的不同研究結(jié)論［6，7］。本研究以不同濃度的Cd在亞急性毒性條件下分別脅迫蝦夷扇貝，通過對(duì)其鰓、消化腺中兩種重金屬含量及GPx、GST活性的檢測(cè)，初步研究了Cd在蝦夷扇貝體組織內(nèi)的沉積規(guī)律及對(duì)谷胱甘肽依賴性酶活性的影響，明確了GPx、GST作為蝦夷扇貝Cd污染生物標(biāo)志物的可行性。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)扇貝的來源及養(yǎng)殖條件

成體蝦夷扇貝購自大連獐子島漁業(yè)公司。挑選健康及殼高大小為8．730±0．167cm（means±SD，n＝30）的蝦夷扇貝作為實(shí)驗(yàn)用貝。將扇貝在實(shí)驗(yàn)條件下養(yǎng)殖于溫度為16±1℃及鹽度為30‰的過濾海水中，所用海水來源于青島第一海水浴場(chǎng)。暫養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)期間以螺旋藻作為餌料進(jìn)行投喂，并24h不間斷充氧，每天換水一半，實(shí)驗(yàn)期所換海水以損失的Cd離子進(jìn)行補(bǔ)充。暫養(yǎng)期為7d。

1．2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Cd實(shí)驗(yàn)組共4組（1個(gè)對(duì)照組及3個(gè)脅迫組），每組設(shè)3個(gè)平行，每平行隨機(jī)放養(yǎng)25只實(shí)驗(yàn)用貝于50×40×30cm3的塑料水族箱中。所用脅迫試劑為CdCl2·2．5H2O（購自Sigma公司），加入海水中使Cd2＋終濃度分別為0mg·L－1、0．05 mg·L－1、0．1mg·L－1、0．2mg·L－1。Cd的含量為中國漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的0、10、20及40倍。實(shí)驗(yàn)期為14d，分別在0d、1d、3d、6d、10d、14d隨機(jī)選取3只蝦夷扇貝，并對(duì)鰓、消化腺組織采樣，凍存于－80℃冰箱供測(cè)試分析備用。

1．3 Cd含量測(cè)定

取0d、3d、6d、10d、14d的蝦夷扇貝鰓、消化腺組織，于60℃烘箱中48h烘干至恒重，取約0．5 g鰓或0．2g消化腺加入30mL大小的特氟龍管中，并加入6mL HNO3在室溫下放置1h。將溶液在100℃條件下煮沸6h至澄清，將剩余物在100℃條件下溶解于6mL 1%的HNO3溶液中。Cd含量采用電感耦合等離子質(zhì)譜儀（ICP－MS，Elan 6100，美國）測(cè)定。

1．4 GPx、GST活力測(cè)定

取適量蝦夷扇貝鰓、消化腺組織，稱量后置于10倍體積的預(yù)冷緩沖液中（pH 7．5，0．01mol·L－1Tris－HCl，0．0001mol·L－1EDTA－2Na，0．01mol·L－1蔗糖），并在勻漿器上勻漿，勻漿液于4℃條件下10 000g·min－1離心10min，取上清液待測(cè)。

GPx活性測(cè)定參照Xia等［8］改進(jìn)的方法進(jìn)行。活力單位定義為：每毫克組織蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 nmol為一個(gè)酶活性單位／U·mg－1protein·min－1。

GST活力測(cè)定參照Habig等［9］的方法經(jīng)改進(jìn)后進(jìn)行測(cè)定。酶活力定義為：每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol的2，4二硝基苯谷胱甘肽（2，4－dinitrophenyl glutathione）定義為一個(gè)酶活力單位／U·mg－1protein·min－1。

蛋白含量測(cè)定采用BradfordG－250染色法進(jìn)行［10］。所有吸光值均在Powerwave XS2（BioTek，美國）酶標(biāo)儀上測(cè)定。

1．5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均與對(duì)照組進(jìn)行比較，并采用單因素方差分析（ANOVA）和LSD法進(jìn)行檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS16．0，取P＜0．05做為差異性顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2．1 Cd在蝦夷扇貝鰓、消化腺組織的生物累積

亞急性濃度Cd脅迫實(shí)驗(yàn)表明（圖1），對(duì)照組鰓、消化腺組織實(shí)驗(yàn)期間Cd的含量分別為1．8～3．2μ·g－1和2．41～2．93μ·g－1。兩組織中最大Cd沉積分別出現(xiàn)在10d，0．2mg·L－1脅迫組（鰓，134．20μg·g－1）和14d，0．1mg·L－1脅迫組（消化腺，109．20μg·L－1）。與對(duì)照組相比，分別提高了52倍和36倍。鰓組織中0．1mg·L－1、0．2mg·L－1脅迫組Cd的沉積于10d均達(dá)到最大值，后開始下降，而消化腺組織中各組Cd沉積濃度均隨著脅迫濃度升高、脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，并且消化腺組織中Cd的累積明顯高于鰓組織中Cd的累積。

圖1 Cd在蝦夷扇貝鰓（A）、消化腺（B）組織中的生物累積Fig．1 Accumulation of cadmium （Cd）in gill（A）and digestive gland（B）of Japanese scallop．

2．2 Cd對(duì)蝦夷扇貝鰓、消化腺組織GPx活力的影響

亞急性濃度Cd脅迫對(duì)蝦夷扇貝鰓、消化腺組織GPx活性影響表明（圖2），兩組織中GPx活性總體隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后下降的趨勢(shì)。其中鰓組織在0．05mg·L－1、0．1mg·L－1、0．2 mg·L－1脅迫條件下，分別于6d、3d和1d達(dá)到最大值，0．2mg·L－1脅迫組GPx活性在14d達(dá)到顯著抑制（P＜0．05）。消化腺組織在0．2mg·L－1脅迫條件下，于1d達(dá)到最大值，在0．05mg·L－1、0．1mg·L－1脅迫條件下，于3d達(dá)到最大值。消化腺組織GPx活性顯著高于鰓組織。

圖2 Cd脅迫對(duì)蝦夷扇貝鰓（A）、消化腺（B）GSH－Px活性的影響Fig．2 The effect of Cd on GSH－Px activity in gill（A）and digestive gland（B）of M．yessoensis

2．3 Cd對(duì)蝦夷扇貝鰓、消化腺組織GST活性的影響

亞急性濃度Cd脅迫對(duì)蝦夷扇貝鰓組織GST活性的影響表明（圖3A），各脅迫濃度隨脅迫時(shí)間均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，0．05mg·L－1、0．1mg·L－1、0．2mg·L－1分別于10d、6d和1d達(dá)到最大值。0．2mg·L－1脅迫組在1d后，GST活性顯著下降，6d時(shí)與對(duì)照相比出現(xiàn)顯著性抑制（P＜0．05）。

Cd脅迫對(duì)消化腺組織GST活性影響表明（圖3B），0．2mg·L－1脅迫組在脅迫1d時(shí)GST活性出現(xiàn)顯著性抑制（P＜0．05），后逐步上升。0．05 mg·L－1、0．1mg·L－1脅迫組均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，最大值均出現(xiàn)在6d。

圖3 Cd脅迫對(duì)蝦夷扇貝鰓（A）、消化腺（B）GST活性的影響Fig．3 The effect of Cd on GST activity in gill（A）and digestive gland（B）of M．yessoensis

3 討論

蝦夷扇貝對(duì)不同重金屬在不同組織間的累積存在較大的差異性［11］，本研究結(jié)果表明，隨著脅迫濃度的增加，Cd在鰓及消化腺組織中的累積均出現(xiàn)了極顯著的上升，呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系。此外發(fā)現(xiàn)，鰓組織中0．1mg·L－1、0．2mg·L－1組Cd的含量在10天后下降，說明在前10天的脅迫時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)金屬綁定配體持續(xù)性的與金屬離子結(jié)合，Cd離子穿過細(xì)胞膜而在組織細(xì)胞內(nèi)沉積下來，但10d后由于胞內(nèi)金屬綁定配體綁定位點(diǎn)的飽和，金屬離子不在結(jié)合，而出現(xiàn)下降。但消化腺組織在整個(gè)14天實(shí)驗(yàn)期內(nèi)Cd離子含量均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這可能與消化腺組織是主要的解毒器官，對(duì)金屬離子的耐受力更強(qiáng)有關(guān)。這與Choi研究結(jié)果一致［12］。

抗氧化防御體系是機(jī)體受到異源物質(zhì)脅迫時(shí)重要的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，其中谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）通過消除H2O2來減少機(jī)體損傷。前人研究表明當(dāng)雙殼貝類受到低濃度重金屬脅迫或短時(shí)間脅迫的條件下，抗氧化酶均出現(xiàn)上升，但隨著濃度的上升、脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性可能會(huì)出現(xiàn)降低甚至抑制［13］。這與本研究結(jié)果相一致。Wang等對(duì)蛤的研究顯示，不同濃度Cd脅迫下，鰓及消化腺GPx活性在脅迫24h時(shí)均出現(xiàn)最大值，而本研究結(jié)果顯示，高濃度（0．2mg·L－1）脅迫條件下，GPx活性均在24h出現(xiàn)高峰，而中低濃度脅迫下（0．05mg·L－1、0．1mg·L－1），GPx活性最大值則出現(xiàn)在3d或6d。這可能和物種不同對(duì)Cd的耐受力不同有關(guān)。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）主要功能是催化某些內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原型谷胱甘肽的巰基偶聯(lián)，增加其疏水性使其易于穿越細(xì)胞膜，分解后排出體外，從而達(dá)到解毒的目的，保護(hù)DNA及一些蛋白質(zhì)免受損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，中低濃度Cd（0．05mg·L－1、0．1mg·L－1）脅迫條件下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，GST活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，這與 Wang［15］對(duì)蛤仔（Ruditapes philippinarum）研究的結(jié)果相一致。但在高濃度（0．2mg·L－1）脅迫條件下，鰓中GST在24小時(shí)達(dá)到最大值后迅速降低，消化腺中GST則出現(xiàn)顯著性抑制。這可能與在高濃度下短時(shí)間內(nèi)蝦夷扇貝鰓及消化腺細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷相關(guān)。此外，研究結(jié)果表明消化腺中GPx、GST活性均高于鰓組織，進(jìn)一步驗(yàn)證了消化腺是蝦夷扇貝的主要解毒器官，而鰓是主要的濾過性器官。

生物標(biāo)志物（biomarkers）常被用來偵測(cè)和診斷毒性物質(zhì)對(duì)海洋生物的影響，對(duì)其在分子和細(xì)胞水平的檢測(cè)被推薦用作生物影響評(píng)估的早期監(jiān)測(cè)工具［16］。本研究顯示蝦夷扇貝鰓、消化腺組織GPx、GST活性在不同濃度的Cd脅迫條件下均顯現(xiàn)出了敏感、顯著的變化，據(jù)此我們推斷GPx、GST可作為蝦夷扇貝養(yǎng)殖過程中受到Cd污染時(shí)的早期環(huán)境生物監(jiān)測(cè)的敏感生物標(biāo)志物。

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