韓燕峰 張延威 董旋 黃玉 梁宗琦

摘要：研究蛹蟲草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）的發(fā)酵液和菌絲提取物的抑菌效果，為蛹蟲草抑菌活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。采用濾紙柱、海綿柱和花泥柱３種方法檢測其抑菌效果，結(jié)果表明蛹蟲草發(fā)酵液及菌絲提取物對大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）和金黃色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）均有一定抑制作用，其中菌絲提取物抑菌作用較強；對大腸桿菌的抑制強于對金黃色葡萄球菌的抑制。抑菌效果檢測方法以濾紙柱法檢測效果較好，花泥柱法次之，海綿柱法較差。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草；抑菌；檢測方法；發(fā)酵液；菌絲提取物

中圖分類號：Ｓ５６７．３５；Ｑ９３９．９６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）16－3492-04

Studies on Antibacterial Activities of Fermentation Broth and Mycelia Extraction of Cordyceps militaris

ＨＡＮ Ｙａｎ－ｆｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ－Ｗｅｉ２，ＤＯＮＧ Ｘｕａｎ１，ＨＵＡＮＧ Ｙｕ1，ＬＩＡＮＧ Ｚｏｎｇ－ｑｉ1

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｕｎｇｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，China；

２． Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００１８，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ａｎｄ ｍｙｃｅｌｉａ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｄａｙｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ． For ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ， ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ method ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ by ｆｌｏｗｅｒ ｍｕｄ ｃｏｌｕｍｎ， ｔｈｅ ｗｏｒｓｔ ｗａｓ ｓｐｏｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｙｃｅｌｉａ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｂｏｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ stronger ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ； ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｏｔｈ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｏｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗａｓ stronger ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ； ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ； ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ； ｍｙｃｅｌｉａ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

蛹蟲草又名北冬蟲夏草，是我國名貴中藥材冬蟲夏草的代用品，含有多種生物活性物質(zhì)［１，２］。蛹蟲草為蟲、菌結(jié)合體，其真菌也常被稱為蛹蟲草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）。研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草的子實體、菌絲體和發(fā)酵液中均有多種活性成分，能抑制部分細菌和真菌，對人體具有一定的保健功效，具有潛在應(yīng)用前景［３－５］。一些關(guān)于蛹蟲草的研究認為，蛹蟲草的抗菌成分可能是蟲草素［６，７］、多糖［８］、多肽［９］、酶類［１０］或酚類［１１］，具有抑菌作用可能是單一成分導致也有可能是多組分協(xié)同作用。劉陽等［１２］報道發(fā)酵液的抑菌效果是單一活性成分抑菌效果的２倍，表明蛹蟲草中多種活性成分共同作用的抑菌效果好于單一活性成分的抑菌效果。但針對某一種微生物而言，其主要抑菌活性物質(zhì)應(yīng)該是一類或一種物質(zhì)。

試驗采用３種檢測材料對蛹蟲草菌絲提取物和發(fā)酵液進行抑菌效果檢測比較，和常用的抑菌效果檢測采用的濾紙片法和牛津杯法有所不同。同時比較不同發(fā)酵天數(shù)的蛹蟲草發(fā)酵液和菌絲提取物的抑菌效果，以期為蛹蟲草抑菌活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

１材料與方法

１．１供試菌株

蛹蟲草ＧＺＵＩＦＲ－ＺＨ菌株、大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、金黃色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）為貴州大學真菌資源研究所微生物實驗室保存。

１．２培養(yǎng)基

ＰＤＡ固體培養(yǎng)基：馬鈴薯２００ ｇ去皮切塊，煮沸３０ ｍｉｎ后６層紗布過濾，加入葡萄糖、瓊脂各２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ。１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ。

蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯２００ ｇ去皮切塊，煮沸３０ ｍｉｎ后６層紗布過濾，加入葡萄糖２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，分裝至２５０ ｍＬ三角瓶中，每瓶裝液１００ ｍＬ。１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏３ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，ＮａCｌ ５ ｇ，瓊脂２０ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ。

細菌培養(yǎng)液：牛肉膏３ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，ＮａCｌ ５ ｇ，水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ。

１．３試驗方法

１．３．１母液培養(yǎng)與發(fā)酵蛹蟲草菌種活化后，從ＰＤＡ斜面試管中挑取適當大小的菌塊，接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，１７０ ｒ／ｍｉｎ ２５ ℃搖床培養(yǎng)，待母液孢子數(shù)達到１０６個／ｍＬ時用移液槍吸取母液轉(zhuǎn)接至新的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量每瓶１ ｍＬ，１７０ ｒ／ｍｉｎ ２５ ℃搖床培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)周期為１０ ｄ。

１．３．２抑菌材料制作濾紙柱：?。磸埗ㄐ詾V紙為一疊，用打孔器打孔得到直徑為６ ｍｍ的濾紙片，壓平后分裝入潔凈的培養(yǎng)皿中，１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ，放入烘箱烘干，使用時５疊濾紙片為一組（即一個濾紙柱由２０張濾紙片組成）。

海綿柱：取規(guī)整、質(zhì)地均勻的海綿塊（購自超市），用打孔器打孔得到直徑為８ ｍｍ、高７ ｍｍ的海綿柱，分裝入潔凈的培養(yǎng)皿，１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ，放入烘箱烘干。

花泥柱：取無損、質(zhì)地均勻的花泥塊（購自花店），用打孔器打孔得到直徑為７ ｍｍ、高７ ｍｍ的花泥柱，分裝入潔凈的培養(yǎng)皿，１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ，放入烘箱烘干。

１．３．３菌絲提取液制備準確稱?。埃保?ｇ烘干后的菌絲，放于１．５ ｍＬ蒸餾水中，于超聲波振蕩儀中提?。常?ｍｉｎ。

１．３．４細菌菌懸液制備供試菌種活化后，從斜面培養(yǎng)基刮下部分菌體，接種于細菌培養(yǎng)液中，３７ ℃培養(yǎng)１８ ｈ，培養(yǎng)后的菌液用血球計數(shù)板計數(shù)，以細菌培養(yǎng)液調(diào)整細菌濃度至１０６個／ｍＬ，制成細菌菌懸液。

１．３．５瓊脂擴散法（Ｋ－Ｂ法）試驗

１）取已滅菌的干凈培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿倒入約２０ ｍＬ的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，靜置待其凝透，取水平無冷凝水的平板使用。用移液槍移?。保担?μＬ細菌菌懸液添加到平板，涂布均勻，靜置３０ ｍｉｎ待菌液吸收。

２）用移液槍移取培養(yǎng)１～１０ ｄ的發(fā)酵液或菌絲提取液１００ μＬ分別加到已滅菌干燥的濾紙柱、海綿柱及花泥柱上，再將其移入平板中如圖１的相應(yīng)位置，每個平板每種材料設(shè)對照１個、供試液１個，共６個，３種材料間隔放置，各材料間距離相等。３個重復。發(fā)酵液的空白對照為蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基，菌絲提取物的空白對照為蒸餾水。

３）將上述平板移入冰箱中靜置，待液體充分浸漬到培養(yǎng)基后３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ，觀察記錄抑菌圈大小，十字交叉法測量抑菌圈直徑，取其平均值。

２結(jié)果與分析

２．１蛹蟲草發(fā)酵液的抑菌效果

含發(fā)酵液的濾紙柱、海綿柱和花泥柱對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表１、圖２。由表１、圖２可見，海綿柱法未能檢測到抑菌效果，而采用濾紙柱和花泥柱的僅培養(yǎng)７ ｄ的發(fā)酵液出現(xiàn)抑菌效果，且對大腸桿菌的抑制作用強于對金黃色葡萄球菌的抑制作用。說明在試驗中培養(yǎng)７ ｄ的發(fā)酵液抑菌物質(zhì)含量最高，而其余時間可能是因為抑菌物質(zhì)含量低未能檢測到抑菌效果。

２．２蛹蟲草菌絲提取物的抑菌效果

含菌絲提取物的濾紙柱、海綿柱和花泥柱對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表２、圖３。由表２、圖３可見，培養(yǎng)４ ｄ后的菌絲提取物在濾紙柱法和花泥柱法檢測中出現(xiàn)抑菌效果，且隨培養(yǎng)時間的增加，菌絲提取物的抑菌作用增強。培養(yǎng)９ ｄ的菌絲提取物在海綿柱法檢測中表現(xiàn)出抑菌效果，抑菌圈較前兩種方法小。同時可看出菌絲提取物對大腸桿菌的抑制作用強于對金黃色葡萄球菌的抑制作用。

在試驗條件下３種材料用于抑菌檢測的效果為：濾紙柱效果最佳，花泥柱次之，海綿柱最差。

２．３菌絲提取物和發(fā)酵液抑菌效果比較

對不同培養(yǎng)時間的蛹蟲草發(fā)酵液和菌絲提取物的抑菌效果進行比較。結(jié)果表明，只有培養(yǎng)７ ｄ的發(fā)酵液檢測出抑菌效果，而從培養(yǎng)４ ｄ開始菌絲提取物表現(xiàn)出抑菌作用，且抑菌作用隨培養(yǎng)時間的增加呈上升趨勢。比較表１和表２數(shù)據(jù)，可見蛹蟲草菌絲提取物的抑菌效果強于發(fā)酵液的抑菌效果。

３小結(jié)與討論

１）試驗中為保證使用的３種材料測定的抑菌效果具有可比性，以濾紙柱所能吸收的最大加液量為限，設(shè)計加液量為１００ μＬ，但實際使用中海綿柱及花泥柱可吸收的最大加液量遠遠大于１００ μＬ，故可能存在花泥柱與海綿柱因加液量不足未能表現(xiàn)出應(yīng)有的檢測效果。在試驗操作方面，累加５疊濾紙片需要花費較長時間，容易導致細菌污染，移動及擺放存在一定難度；海綿柱因無法主動吸水，需要擠壓才能將液體吸入，操作麻煩，也存在較大被污染的可能性；花泥柱可主動吸收液體，拿取容易，擺放方便，較前兩者更為方便。綜合考慮吸液量大小與操作簡便性，推測使用花泥柱只要方法恰當，就能達到較好的檢測效果，具體情況有待下一步試驗驗證。

２）試驗中的發(fā)酵液具有抑菌效果，這與武忠偉等［４］的報道一致。陳宏偉等［８］報道蟲草多糖具有較強的抑菌活性，對大腸桿菌的抑菌圈直徑達１１．３ ｍｍ，本試驗采用超聲波法提取的菌絲提取物的抑菌活性也較強，培養(yǎng)１０ ｄ其對大腸桿菌的抑菌圈直徑達到１２．５0 ｍｍ。由于試驗采用的是粗提液，發(fā)酵液的抑菌成分和菌絲提取物的抑菌成分的確定還有待進一步研究。

３）從試驗結(jié)果可見，濾紙柱在檢測蛹蟲草培養(yǎng)物的抑菌效果中表現(xiàn)較好，花泥柱次之，海綿柱較差；蛹蟲草發(fā)酵液和菌絲提取物均有抑菌作用，總體上對大腸桿菌的抑制強于對金黃色葡萄球菌的抑制；菌絲提取物的抑菌作用強于發(fā)酵液。

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