謝麗 孫瑞珠 馬玉龍 李俊蓮

摘要：離心收集泰樂菌素降解菌，超聲破碎菌體后，測(cè)定不同濃度菌液的電導(dǎo)率值。結(jié)果表明，完全破碎后的菌液電導(dǎo)率值與細(xì)胞干重存在良好的線性關(guān)系，線性系數(shù)（Ｒ２＝０．９９９ ８），該方法能快速、準(zhǔn)確地分析泰樂菌素降解菌的生長量。

關(guān)鍵詞：生長量；泰樂菌素降解菌；電導(dǎo)率

中圖分類號(hào)：Ｑ９３－３３文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）16－3601-02

Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｔｙｌｏｓｉｎ－Dｅｇｒａｄｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ Ｃｏｎｄｕｃｔｏｍｅｔｅｒ

ＸＩＥ Ｌｉ，ＳＵＮ Ｒｕｉ－ｚｈｕ，ＭＡ Ｙｕ－ｌｏｎｇ，ＬＩ Ｊｕｎ－ｌｉａｎ

（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００21， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｌｉｑｕｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｂｌｅｎｄｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｖｅ． Ｔｈｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｃｏｎｄｕｃｔｍｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｐｅｒｆｅｃｔ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒ２＝０．９９９ ８． Ｉｎ ａ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｉｔ ｗａｓ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｒｏｗｔｈ ｑｕａｎｔｉｔｙ； ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ

細(xì)菌在生長繁殖過程中，可通過測(cè)定細(xì)菌的生長量，來了解細(xì)菌的各種生理生化狀態(tài)。目前，細(xì)菌生長量的測(cè)定主要有４類方法：細(xì)胞數(shù)目的測(cè)量（直接顯微計(jì)數(shù)法、平板活菌技術(shù)、載片培養(yǎng)技術(shù)、微孔過濾法、庫爾特計(jì)數(shù)器、流動(dòng)細(xì)胞光度法、表熒光濾過技術(shù)、熒光抗體技術(shù)、微型ＥＬＩＳＡ、電子顯微鏡）；細(xì)胞量的測(cè)量（干重法、比濁法、離心壓縮細(xì)胞體積法）；細(xì)菌濃度的間接測(cè)量（通過測(cè)定核酸、蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、ＡＴＰ等含量來估算菌濃度，或通過測(cè)量Ｃ、Ｎ、Ｏ和Ｐ等元素的含量間接計(jì)算菌濃度）；生物量在線檢測(cè)（微熱量計(jì)法、熒光法、電容／電導(dǎo)／阻抗法等）［１］。其中比濁法檢測(cè)成本低、快速，而在線檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確，可實(shí)時(shí)分析細(xì)菌生長過程中的生長量，因此具有較好的應(yīng)用前景。該文以早期分離篩選的泰樂菌素降解菌——無丙二酸檸檬酸桿菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）為材料［２］，比較了活菌稀釋計(jì)數(shù)法、比濁法和電導(dǎo)率法繪制該菌生長曲線的差異，為研究該菌的形態(tài)學(xué)特征、適應(yīng)性及泰樂菌素降解機(jī)理提供其生長量參數(shù)。

１材料與方法

１．１菌株來源

泰樂菌素降解菌（無丙二酸檸檬酸桿菌，由課題組分離篩選得到并保藏）。

１．２培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

酵母浸出粉胨葡萄糖（ＹＰＤ）培養(yǎng)基：酵母提取物１ ｇ，蛋白胨２ ｇ，葡萄糖２ ｇ，水１００ ｍＬ。

培養(yǎng)條件：細(xì)胞干重為０．３ ｇ／ｍＬ，１０％接種量，３０ ℃，１２５ ｒ／ｍｉｎ條件下培養(yǎng)。

１．３儀器

ＴＧＬ－２０Ｍ型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、ＤＨＳ１６－Ａ烘干稱量法水分測(cè)定儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、ＤＤＳ－１２Ａ型數(shù)字式電導(dǎo)率儀（杭州東星儀器設(shè)備廠）、ＪＹ９８－ＩＩＩＮ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）、ＵＶ－１２００型紫外可見分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）。

１．４方法

１．４．１ 干重法取泰樂菌素降解菌培養(yǎng)液１０ ｍＬ，于１０５ ℃烘干樣品，測(cè)定細(xì)胞干重，每個(gè)樣品測(cè)定３次。

１．４．２電導(dǎo)率法取培養(yǎng)４８ ｈ的泰樂菌素降解菌菌液，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４ ℃離心２ ｍｉｎ，用去離子水清洗沉淀２次，以去離子水配制成不同濃度的菌液，用烘干稱量法測(cè)定細(xì)胞干重；采用超聲法破碎降解菌的細(xì)胞（５００ Ｗ超聲６次，３０ ｓ／次，２０ ｓ／間隔），超聲后，取０～５．０ ｍＬ系列體積的菌液，以去離子水定容至５．０ ｍＬ。用ＤＤ－１２Ａ型電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率值，每個(gè)樣品測(cè)定３次。

１．４．３比濁法采用上述樣品液，于５００ ｎｍ下測(cè)定菌液的ＯＤ５００ ｎｍ，每個(gè)樣品測(cè)定３次。

１．４．4活菌稀釋計(jì)數(shù)法［３］?。埃?ｍＬ菌液，以磷酸鹽緩沖液為稀釋液，按１０倍梯度稀釋８?jìng)€(gè)梯度，每個(gè)稀釋度涂布ＹＰＤ平板，設(shè)３個(gè)平行，培養(yǎng)９６ ｈ后，選取１０～３００個(gè)菌落數(shù)的平板計(jì)數(shù)。

１．４．5生長曲線的測(cè)定?。矗?ｈ培養(yǎng)后的泰樂菌素降解菌種子液，將種子液按１０％的接種量培養(yǎng)，分別在８～７２ ｈ中，間隔８ ｈ取樣。用活菌計(jì)數(shù)法測(cè)量培養(yǎng)基中細(xì)菌濃度，同時(shí)以１２１ ℃，滅菌２０ ｍｉｎ的ＹＰＤ培養(yǎng)基為對(duì)照，采用比濁法測(cè)定菌液濃度，重復(fù)３次，計(jì)算平均值；分別在８～７２ ｈ間，每間隔４ ｈ取菌液１ ｍＬ，加入裝有３０ ｍＬ去離子水的試管中，同上條件超聲處理，取細(xì)胞破碎后的菌液５．０ ｍＬ，用ＤＤ－１２Ａ型電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率值，每個(gè)樣品測(cè)定３次，計(jì)算平均值。繪制泰樂菌素降解菌培養(yǎng)時(shí)間與Ｉｎ（ｃｆｕ／ｍＬ）以及ＯＤ５００ ｎｍ和電導(dǎo)率值的生長曲線。

２結(jié)果

２．１泰樂菌素降解菌的生長曲線

分別采用活菌稀釋計(jì)數(shù)法、電導(dǎo)率法和比濁法對(duì)泰樂菌素降解菌的生長曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖１，圖２所示?；罹♂層?jì)數(shù)法測(cè)定的降解菌生長曲線符合細(xì)菌生長的各個(gè)階段：０～８ ｈ為降解菌生長的延遲期，８～２４ ｈ為對(duì)數(shù)生長期，２４～５６ ｈ為穩(wěn)定期，５６～７２ ｈ為衰亡期。電導(dǎo)率法測(cè)定的生長曲線也有明顯的延遲期、對(duì)數(shù)生長期和穩(wěn)定期，且延遲期和對(duì)數(shù)生長期的時(shí)間范圍和活菌稀釋計(jì)數(shù)法相似，但此法所測(cè)到的穩(wěn)定期為２４～７２ ｈ，無衰亡期。而分光光度法的生長曲線始終保持上升狀態(tài)，無明顯的延遲期、對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。

２．２破碎細(xì)胞的電導(dǎo)率

早期預(yù)試驗(yàn)中，泰樂菌素降解菌用去離子水清洗和定容后，發(fā)現(xiàn)菌液的電導(dǎo)率會(huì)隨放置時(shí)間延長而增大，初步推測(cè)菌體細(xì)胞會(huì)向外釋放游離電解質(zhì)。通過超聲波破碎細(xì)菌細(xì)胞，讓電解質(zhì)迅速游離出菌體，測(cè)定放置不同時(shí)間的破碎細(xì)胞菌液電導(dǎo)率來驗(yàn)證上述推斷。

在相同超聲條件下破碎不同體積細(xì)菌細(xì)胞，在自然冷卻不同時(shí)間后，用電導(dǎo)率儀測(cè)量菌液電導(dǎo)率，結(jié)果見圖３。由圖３可知，在不同時(shí)間內(nèi)，２００ ｍＬ降解菌菌液的電導(dǎo)率變化幅度較大。這是因?yàn)椴煌w積中細(xì)菌細(xì)胞量不同，采用相同的超聲破碎條件，細(xì)胞量越多，析出的電解質(zhì)越多，進(jìn)而導(dǎo)致２００ ｍＬ菌液電導(dǎo)率的變化幅度大于５０ ｍＬ菌液。

在不同超聲次數(shù)的條件下，相同體積菌液的電導(dǎo)率隨時(shí)間的變化結(jié)果如圖４。由圖４可知，超聲次數(shù)對(duì)菌液電導(dǎo)率影響較大。６次超聲處理菌液的電導(dǎo)率隨放置時(shí)間的變化為＋０．０１ μＳ／ｃｍ；４次超聲處理菌液的電導(dǎo)率隨放置時(shí)間的變化為＋０．４３ μＳ／ｃｍ；２次超聲處理菌液的電導(dǎo)率隨放置時(shí)間的變化為＋０．３４ μＳ／ｃｍ，并且放置９０ ｍｉｎ后，２次和４次超聲處理菌液的電導(dǎo)率仍未達(dá)到６次超聲處理的水平。故該試驗(yàn)采用的條件為：取２００ ｍＬ菌液，５００ Ｗ超聲６次，３０ ｓ／次，每次間隔２０ ｓ。在該條件下，泰樂菌素降解菌菌液的電導(dǎo)率值與泰樂菌素降解菌細(xì)胞干重存在良好的線性關(guān)系（圖５）。

３小結(jié)與討論

由于菌體細(xì)胞的性狀特征和培養(yǎng)基組分影響，可采用電導(dǎo)率法來替代比濁法測(cè)定細(xì)菌的生長曲線和生長量。因?yàn)樵诰w細(xì)胞含量較大時(shí)，在液體培養(yǎng)基中容易下沉，采用比濁法會(huì)存在一定誤差，另外，培養(yǎng)基的成分也會(huì)干擾細(xì)菌細(xì)胞的滲透情況，進(jìn)而影響菌液的折射率以及渾濁程度。而采用濁度法時(shí)，不超過０．６５的吸光度才與菌體間存在較好的線性關(guān)系，而采用電導(dǎo)率值分析細(xì)菌生物量則沒有此類限制。由于細(xì)胞計(jì)數(shù)法、細(xì)胞干重和濕重法、活菌計(jì)數(shù)法（平板菌落計(jì)數(shù)、ＭＰＮ法、試劑紙法、膜過濾等）以及測(cè)定生理指標(biāo)法（定氮和ＤＮＡ含量測(cè)定）操作繁瑣且耗時(shí)耗能，因此，采用快速準(zhǔn)確的電導(dǎo)率法，將有較好的應(yīng)用前景。

電導(dǎo)率值之所以能夠較為準(zhǔn)確地反映降解菌的生長量，主要有兩個(gè)原因：其一，細(xì)胞釋放了無機(jī)鹽離子，其二，細(xì)胞中不導(dǎo)電的生物大分子物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的各種物質(zhì)代謝過程中分解成了導(dǎo)電的小分子物質(zhì)［４］，但采用電導(dǎo)率法時(shí)，其電信號(hào)會(huì)受到培養(yǎng)基成分、ｐＨ、氣泡等因素干擾［５］。為此，筆者發(fā)現(xiàn)采用去離子水清洗并稀釋菌液，可較好地減少干擾。綜上所述，采用電導(dǎo)率法能夠準(zhǔn)確快速地測(cè)定泰樂菌素降解菌的生長量，該方法的建立將為篩選泰樂菌素藥渣中的降解菌株提供較好的評(píng)價(jià)方法。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 沈萍，陳向東．微生物學(xué)［Ｍ］． 第二版．北京：高等教育出版社，２００６．１５１－１５４．

［２］ 劉力嘉，謝麗，張作義，等．泰樂菌素高效降解菌的篩選及降解特性研究［Ｊ］．農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，２０１１，３０（５）：１０２７－１０３０．

［３］ 任曉燕，剡根強(qiáng)，周霞．糞腸球菌生長曲線的測(cè)定［Ｊ］．獸醫(yī)雜志，２００５，２４（６）：１０－１１．

［４］ ＳＶＥＮＳＳＯＮ Ｕ Ｋ． Ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Dａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，７７（１２）：３５１６－３５２３．

［５］ ＳＩＮＧＨ Ａ， ＫＵＨＡＤ Ｒ Ｃ， ＳＡＨＡＩ Ｚ Ｖ， ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ ［Ｊ］． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５１：４７－７０．