高翠華，姜 恒

（遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，遼寧 撫順 113001）

分析測(cè)試

索氏提取-HPLC-ELSD法檢測(cè)銀杏葉片中萜類內(nèi)酯的含量

高翠華，姜 恒

（遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，遼寧 撫順 113001）

建立一種基于索氏提取的綠色樣品前處理技術(shù)，采用HPLC-ELSD法測(cè)定銀杏葉片中總萜類內(nèi)酯的含量。結(jié)果表明，銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯均有良好的線性范圍，回收率均大于98%，檢測(cè)量在52～108 ng之間，且方法具有較好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。輔料無(wú)干擾。本方法可有效用于銀杏葉片中萜類內(nèi)酯的提取與測(cè)定。

銀杏葉片；萜類內(nèi)酯；索氏提取-HPLC-ELSD法

銀杏葉片系2005年藥典收錄的中藥品種[1]，是由銀杏葉提取物經(jīng)加工制成的制劑，用于治療心腦血管疾病及多種復(fù)雜性疾病，效果顯著。萜類內(nèi)酯是銀杏葉片的主要成分之一，主要包括銀杏內(nèi)酯A（C20H24O9）、B（C20H24O10）、C（C20H24O11）和白果內(nèi)酯(C15H18O8)[2,3]

銀杏葉片中萜類內(nèi)酯的含量極低，目前提取方法主要有三種：溶劑萃取法，溶劑萃取-柱層析法和超臨界流體萃取法[4,5]，其中以溶劑萃取法應(yīng)用最廣泛，弊端是該方法需要采用大量的極性或中等極性的有機(jī)溶劑，嚴(yán)重污染環(huán)境。本次樣品前處理方法采用索氏提萃取代替?zhèn)鹘y(tǒng)的液液萃取，采用加熱的方式冷凝回流，減少有機(jī)溶劑使用量，保護(hù)環(huán)境。關(guān)于萜類內(nèi)酯的含量測(cè)定方法主要有 TLC法，HPLC－UV法， HPLC－RI法， GC－MS法和HPLC-ELSD法等，其中HPLC-ELSD法是比較理想的一種方法[6,7]。本實(shí)驗(yàn)亦采用 HPLC-ELSD法，使用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別計(jì)算白果內(nèi)酯、銀杏葉內(nèi)酯A、銀杏葉內(nèi)酯B和銀杏葉內(nèi)酯C的含量，四種銀杏內(nèi)酯的含量之和即為總萜類內(nèi)酯含量。

1 主要儀器與試劑

日本島津 LC-10ATvp高效液相色譜儀，奧泰2000 ELSD檢測(cè)器；甲醇，四氫呋喃和正丙醇均為色譜純(國(guó)藥集團(tuán)有限公司)，乙酸乙酯為分析純(國(guó)藥集團(tuán)有限公司)，水為重蒸餾水；銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；銀杏葉片由北京阜康仁公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

色譜柱：C18柱，4.6 mm×250 mm，5μm（迪馬公司, 鉆石系列）；流動(dòng)相：正丙醇-四氫呋喃－水（1∶35∶64）； 流速：1.0 mL/min；ELSD檢測(cè)器，漂移管溫度99.5 ℃，載氣流速2.58 L/min；理論板數(shù)按白果內(nèi)酯峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500,銀杏內(nèi)酯A與銀杏內(nèi)酯C峰的分離度應(yīng)大于1.5。

2.2 色譜峰定位溶液的制備

取白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A，銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C對(duì)照品各約1 mg,分別加適量甲醇制成對(duì)照溶液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備

分別精密稱取白果內(nèi)酯對(duì)照品，銀杏內(nèi)酯A對(duì)照品，銀杏內(nèi)酯B對(duì)照品，銀杏內(nèi)酯C對(duì)照品各約10, 5, 5, 5 mg，加甲醇制成每1 mL各2, 1, 1, 1 mg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。

取銀杏葉片粉碎研細(xì)后粉末約5 g，精密稱定，用定性濾紙包好，置索氏提取器中，加入20 mL乙酸乙酯和2%鹽酸2滴，置80 ℃冷凝回流20 min，冷卻，取出，回收醋酸乙酯至干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照試驗(yàn)

按工藝制備不含銀杏提取物的陰性樣品，照上述供試品溶液的制備方法制備成陰性對(duì)照品溶液，即得。分別精密吸取色譜峰定位溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1和圖2。及塔板數(shù)符合規(guī)定，色譜峰從左到右依次是銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯A、白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯B,輔料無(wú)干擾。

圖1 銀杏葉片中萜類內(nèi)酯的對(duì)照品圖譜Fig.1 The chromatography of terpens lactones in standard solution

2.5 線形關(guān)系和線性范圍的考察

取白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C對(duì)照品各約10, 5, 5, 5 mg，精密稱定，置同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，分別精密吸取適量，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線， 試驗(yàn)結(jié)果表明：銀杏內(nèi)酯C在7.968 μg～27.888 μg范圍內(nèi)，銀杏內(nèi)酯 A在 8.272～28.952 μg范圍內(nèi), 白果內(nèi)酯在16.4～57.4 μg范圍內(nèi)，銀杏內(nèi)酯B在9.376～32.816 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)與峰面積的對(duì)數(shù)間均有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，測(cè)定試驗(yàn)精密度，結(jié)果表明，連續(xù)5次進(jìn)樣，峰面積的RSD%均＜2.0%，說(shuō)明本方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取銀杏葉片樣品，按上述供試品溶液的制備方法制備成供試品溶液，分別在0，2，4，6，8 h進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，結(jié)果表明，RSD%分別為0.43%，0.86%，1.52%和0.65，說(shuō)明本方法穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性考察

取同一批銀杏葉片樣品6份，按上述含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定含量，結(jié)果RSD%分別為1.06%，0.58%，1.41%和0.32，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法測(cè)定。取已知含量的銀杏葉片樣品粉碎研細(xì)后粉末約2.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，再分別精密加入適量的銀杏內(nèi)酯C,銀杏內(nèi)酯A,白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯B的對(duì)照品 （各約相當(dāng)于2.5 g供試品所含的量）,依上法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：銀杏內(nèi)酯A, B, C和白果內(nèi)酯的回收率分別為 98.76%，99.19%，99.83%和98.39%，即本法具有良好的回收率。

2.10 最低檢出量

取重復(fù)性項(xiàng)下樣品溶液1 mL，用甲醇溶液逐步稀釋定，分別得到銀杏內(nèi)酯C，銀杏內(nèi)酯A，銀杏內(nèi)酯B和白果內(nèi)酯的最小檢出量分別為52.2, 147.8, 64.0, 73.4 ng.

2.11 銀杏葉片含量測(cè)定

按照以上方法制備供試品溶液，測(cè)定3批中試樣品（阜康仁制藥公司提供）中萜類內(nèi)酯的含量，每批樣品測(cè)定兩次，見表2。結(jié)果表明3批樣品含量均＞ 2.4 mg/片，結(jié)合2005年版藥典，含量符合規(guī)定[1]。

表1 銀杏葉片中萜類內(nèi)酯的回收率測(cè)定結(jié)果Table 1 The recovery results of terpens lactones in ginkgo leaves tablets

表2 銀杏葉片中萜類內(nèi)酯的含量測(cè)定結(jié)果Table 2 The concentration levels of terpens lactones in ginkgo leaves tablets

3 討 論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

關(guān)于萜類內(nèi)酯的含量測(cè)定方法主要有TLC法，HPLC－UV法，HPLC－RI法和GC－MS法等。TLC法受環(huán)境和操作影響大，重現(xiàn)性差；而 GC-MS法需衍生化，操作復(fù)雜。HPLC法若采用普通紫外檢測(cè)器，由于銀杏內(nèi)酯屬末端吸收，測(cè)定干擾大。示差折光檢測(cè)器（RI），為通用型檢測(cè)器，但其對(duì)溫度等外界因素響應(yīng)過(guò)于靈敏，重現(xiàn)性和檢測(cè)靈敏度差。ELSD為質(zhì)量型通用檢測(cè)器，能克服以上缺陷，近年來(lái)應(yīng)用日趨廣泛，故本品含量測(cè)定采用 HPLCELSD法。本文敘述了用HPLC-ELSD檢測(cè)銀杏內(nèi)酯的含量，試驗(yàn)證明本方法重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可準(zhǔn)確的測(cè)定出銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯的含量，從而有效的控制樣品的質(zhì)量。采用ELSD檢測(cè)器測(cè)定銀杏內(nèi)酯時(shí),其峰面積值與樣品進(jìn)樣量的線性關(guān)系不太理想,而將峰面積與樣品進(jìn)樣量分別取對(duì)數(shù)后可得到理想的線性關(guān)系（這種現(xiàn)象與ELSD檢測(cè)器的檢測(cè)機(jī)理是一致的[9][10]），故本品含量測(cè)定采用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算。

3.2 樣品前處理方法的選擇

本次實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯索氏提取20 min。結(jié)果表明，2%鹽酸和80 ℃高溫作用下，萜類內(nèi)酯在乙酸乙酯中溶解性良好，本方法重復(fù)性好，回收率高。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)對(duì)比了索氏提取法和05版藥典的液液萃取法，結(jié)果見表 3?？梢悦黠@看出：兩者的回收率相當(dāng)，均大于98%，但索氏萃取法的有機(jī)溶劑使用量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于液液萃取法的使用量，且操作時(shí)間比較短。故最終選擇采用索氏萃取法，萃取銀杏葉片中的萜類內(nèi)酯。

4 結(jié) 論

銀杏葉的有效成分銀杏內(nèi)酯對(duì)治療心腦血管疾病及多種復(fù)雜疾病時(shí)療效確切，隨著對(duì)銀杏葉制劑研究的逐步深入和臨床經(jīng)驗(yàn)的不斷積累, 它將能夠更廣泛地應(yīng)用于治療各種疾病, 是一種很有前途和價(jià)值的藥物。我國(guó)是銀杏樹的主要產(chǎn)地, 我們應(yīng)充分挖掘利用其資源, 讓它為我國(guó)人民的健康和我國(guó)的醫(yī)藥走向世界做出更大的貢獻(xiàn)。

表3 索氏提取法和05版藥典方法比較結(jié)果Table 3 The comparison results between soxhlet extraction and standard detection method in pharmacopoeia of version 2005

本文敘述了用索氏提取-HPLC- ELSD法檢測(cè)銀杏葉片銀杏內(nèi)酯的含量。索氏提取簡(jiǎn)便高效，且節(jié)省溶劑，保護(hù)環(huán)境，HPLC-ELSD方法靈敏度高且選擇性好。研究結(jié)果表明：本方法具有較好的線性范圍，精密度，穩(wěn)定性，重復(fù)性，回收率和低的檢出限，可有效用于銀杏葉片中萜類內(nèi)酯質(zhì)量控制。

［1］中國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2005年版一部正文[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2005.

［2］張麗穎. 銀杏葉的藥理研究及臨床應(yīng)用近況[J]. 中國(guó)藥事, 2006,20(2) :114-117.

［3］ 余新建,劉育文,高麗麗,朱文娟,劉星. 銀杏內(nèi)酯在心血管方面的應(yīng)用研究探討[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2008,5(9):172.

［4］ 劉大偉,武文斌. 銀杏葉中銀杏內(nèi)酯的提取,分離和測(cè)定方法研究[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào),2011(25):9.

［5］ 劉彬果,張新萍,劉巖.銀杏葉片中萜類內(nèi)酯類化合物的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2011,29(6):421-425.

［6］ 宋偉峰 李瑞明. HPLC- ELSD法測(cè)定銀杏葉茶中總內(nèi)酯的含量[J].藥品鑒定,2011,18(5):40-43.

［7］ 肖飛,譚永霞,王永平,向陽(yáng), 趙娟.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定銀杏葉片中 4 種萜類內(nèi)酯含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2011,29(5):675-677.

Determination of Terpens Lactones in Ginkgo Leaves Tablets by Soxhlet Extraction-HPLC-ELSD Method

GAO Cui-hua，JIANG Heng
（School of Chemistry and Materials Science,Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 113001，China）

A green sample preparation technique based on Soxhlet extraction was established, and then HPLC- ELSD method was used to determine terpens lactones content in Ginkgo tablets. The results show that there are good linear relationships between ginkgolide A, B, C and bilobalide, recoveries all are above 98% and the detection limit is 52～108 ng. The method has excellent precision, stability and reproducibility, so it has the potential ability for extraction and determination of terpens lactones in ginkgo leaves tablets.

Ginkgo Leaves Tablets; Terpens lactones; Soxhlet extraction-HPLC-ELSD

O 657

A

1671-0460（2012）09-0999-04

2012-03-12

高翠華（1981-），女，山東臨沂人，碩士研究生，主要從事綠色化學(xué)相關(guān)方面研究。E-mail：gaoch200906@126.com。