崔瑾，王耀獻(xiàn)，孫衛(wèi)衛(wèi)，劉尚建，沈存，呂杰，王曉楠

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟病發(fā)展到終末期腎病的共同途徑。它以過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)積聚及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生為特征。腎小管間質(zhì)受損時(shí)，小管細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞，隨著病變的加重，繼而轉(zhuǎn)變表型為肌成纖維細(xì)胞，并以α－SMA表達(dá)為特征［1］。因此，α－SMA是衡量腎小管間質(zhì)纖維化的重要指標(biāo)。

和解聚散方是王耀獻(xiàn)教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)得出，從已經(jīng)完成的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察的結(jié)果證實(shí)，和解聚散方能夠改善腎功能，延緩終末期腎臟病進(jìn)程［2－4］?；谝陨侠碚摷扒捌谘芯拷Y(jié)果，本文擬重點(diǎn)探討和解聚散方抗腎纖維化的作用機(jī)制是否與抑制大鼠腎組織α－SMA的表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠120只(體質(zhì)量180～220g，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組:I組假手術(shù)組，II組模型組，III組洛丁新組，IV組和解聚散方組，各30只，供給清潔大鼠飼料，自由飲水、進(jìn)食，每籠5只，保持籠內(nèi)清潔。

1.2 試驗(yàn)藥物 和解聚散方由黃芪、當(dāng)歸、海藻、牡蠣、穿山甲等藥物組成，來(lái)源于東直門醫(yī)院中草藥藥房，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制成煎劑，濃縮后高溫消毒封裝備用，濃度為每毫升含生藥1g。洛丁新(鹽酸苯那普利)購(gòu)自北京諾華制藥有限公司。

1.3 造模及給藥方法 采用右側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)制備UUO模型，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組以5%的水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉后局部剃毛，常規(guī)消毒鋪孔巾，選擇背部正中線肋脊角旁開(kāi)1cm切口，依次切開(kāi)皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，將右側(cè)輸尿管結(jié)扎，然后連續(xù)縫合皮膚。假手術(shù)組手術(shù)入路方式同模型組，進(jìn)入腹腔后分離右輸尿管但不結(jié)扎輸尿管。造模術(shù)后24h開(kāi)始分別灌胃，Ⅰ、Ⅱ組灌胃生理鹽水(3ml/只)，Ⅲ組灌胃洛丁新(1.0mg/kg/d)，IV 組灌胃和解聚散方(9.8g/kg/d)。每組10只大鼠分別于造模術(shù)后第7、14、21天處死，留取梗阻側(cè)腎組織備用。

1.4 試劑 α－SMA小鼠來(lái)源單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色試劑盒 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兩步法免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 腎組織病理檢查 取梗阻側(cè)腎組織，以4%多聚甲醛固定后，脫水、浸蠟、石蠟包埋，切成3μm厚度的石蠟切片，分別行HE染色及Masson染色，光鏡下觀察腎臟皮質(zhì)區(qū)及皮髓交界區(qū)腎小管、腎間質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。

1.5.2 免疫組化檢測(cè) 使用兩步法免疫組化試劑盒，操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，采用光學(xué)顯微鏡(400×)觀察皮質(zhì)腎小管間質(zhì)區(qū)α－SMA的表達(dá)，以光鏡下細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)。半定量分析采用Image Pro plus 6.0多媒體彩色病理圖像分析軟件。光鏡下在皮質(zhì)區(qū)選取10個(gè)不重疊視野，盡量避開(kāi)腎小球和血管，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)面積占總面積的百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13.0計(jì)算機(jī)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)改變 HE、Masson染色觀察可知，假手術(shù)組腎間質(zhì)無(wú)纖維化;模型組出現(xiàn)腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫，且伴有不同程度的腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性及腎小管灶狀萎縮，小管管腔閉塞和/或擴(kuò)張，部分腎小管腔內(nèi)有蛋白或細(xì)胞管型，間質(zhì)纖維化;洛丁新組、和解聚散方組病理變化較模型組減輕。

2.2 免疫組織化學(xué)和半定量分析 假手術(shù)組中α－SMA只在腎組織血管壁上表達(dá);模型組、洛丁新組、和解聚散方組除血管壁上有表達(dá)外，可見(jiàn)大量陽(yáng)性表達(dá)出現(xiàn)在腎間質(zhì)細(xì)胞胞漿中，同時(shí)部分小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)也出現(xiàn)陽(yáng)性染色顆粒。半定量分析顯示，模型組、洛丁新組、和解聚散方組中α－SMA在術(shù)后7天、14天、21天表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)，兩個(gè)治療組的表達(dá)水平明顯低于模型組(P＜0.05)，和解聚散方組14天與洛丁新組14天比較有顯著性差異(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)α－SMA表達(dá)的比較(±s)

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)α－SMA表達(dá)的比較(±s)

注:與假手術(shù)比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05;與洛丁新組比較，△P＜0.05;與同組第7天比較，★P＜0.05;與同組第14天比較，▲P ＜0.05。

組別 時(shí)間(天) α－SMA陽(yáng)性表達(dá)面積(%)0.039 7 ±0.024 85模型組 7 5.890 9 ±2.051 74*14 7.380 9 ±2.256 39*21 10.684 8 ±3.390 23＊★▲洛丁新組 7 2.419 7 ±0.731 51*#14 4.843 0 ±3.042 69＊★21 3.660 8 ±1.359 94*和解聚散方組 7 1.856 1 ±1.305 75*#14 1.940 8 ±0.882 11*#△21 2.204 4 ±0.317 02*#假手術(shù)

3 討論

UUO模型是目前公認(rèn)的較為成熟的一種研究腎小管間質(zhì)纖維化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。輸尿管結(jié)扎后隨著病變進(jìn)展，間質(zhì)纖維化形成，最終導(dǎo)致整個(gè)腎臟彌漫性損害，在本實(shí)驗(yàn)中亦得到證實(shí)。

α－SMA作為一種細(xì)胞骨架蛋白，廣泛分布于平滑肌、肌上皮細(xì)胞、周細(xì)胞和一些基底細(xì)胞中，正常腎臟中僅有血管平滑肌細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)α－SMA，其它細(xì)胞通常不表達(dá)α－SMA。在腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中肌成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，并在ECM過(guò)度沉積，該細(xì)胞主要表達(dá)α－SMA，α－SMA是肌成纖維細(xì)胞激活的特異性標(biāo)志物。

腎組織α－SMA表達(dá)增高，表明腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞這些腎臟固有細(xì)胞被激活和異常增殖，具有肌成纖維細(xì)胞特性，合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)增多，參與腎臟的纖維化。即這些細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，由靜止表型轉(zhuǎn)化為增殖表型或分泌表型。

腎纖維化的中醫(yī)病機(jī)是“腎絡(luò)微型癥瘕”形成，消癥散結(jié)在腎纖維化的治療中具有重要意義。王耀獻(xiàn)教授創(chuàng)立和解聚散方，并以此加減治療慢性腎臟病，在臨床中取得了較好療效。和解聚散方由黃芪、當(dāng)歸、海藻、牡蠣、穿山甲等藥物組成，方中以黃芪、當(dāng)歸為君，補(bǔ)血活血，補(bǔ)氣扶正;穿山甲，海藻，牡蠣為臣，消癥散結(jié)，諸藥共奏和解聚散，扶正通絡(luò)之功。全方虛實(shí)并調(diào)，標(biāo)本兼顧，為治療腎纖維化的有效方劑?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，黃芪能清除氧自由基，通過(guò)抑制TGF－β產(chǎn)生，減少ECM生成，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫及體液免疫，降低尿蛋白，保護(hù)腎功能［5－6］。黃芪當(dāng)歸合劑可明顯抑制大鼠腎小球內(nèi)和腎小管間質(zhì)部位α－平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，下調(diào)JNK信號(hào)通路活化，從而抑制腎小球MsC表型轉(zhuǎn)化［7－8］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和解聚散方能夠降低UUO大鼠腎組織中α－SMA的產(chǎn)生，減緩腎纖維化的發(fā)展。充分說(shuō)明了和解聚散方具有良好的抗腎纖維化作用，抑制腎臟固有細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及α－SMA的表達(dá)是其抗腎纖維化的機(jī)制之一，也說(shuō)明了本方是一種防治延緩慢性腎臟病進(jìn)展的有效中成藥物，有必要進(jìn)行深入研究和臨床推廣應(yīng)用。

［1］ 付平，張翥，馮梅，等.苦參堿對(duì)腎小管間質(zhì)CTGF和α－SMA影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.四川醫(yī)學(xué)，2005，26(10):1074 －1076.

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