靳如芳 郭 舜 張金曉 邸志權(quán) 田義紅

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津市新藥安全評(píng)價(jià)中心，天津 300301

甘草次酸是傳統(tǒng)中藥甘草發(fā)揮抗炎作用的主要藥效成分。20 世紀(jì)50年代開始，中外許多學(xué)者研究證明甘草次酸具有抗炎作用，對多種急、慢性炎癥均有明顯的抑制作用[1-2]。甘草次酸類藥物對機(jī)體免疫功能影響復(fù)雜。Yoshikama等[3]研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素可選擇性地增強(qiáng)輔助性T淋巴細(xì)胞的增殖能力和活性，使CD3+CD4+細(xì)胞增加，CD3+CD8+細(xì)胞減少。甘草酸類具有非特異性免疫調(diào)節(jié)作用，主要是增強(qiáng)細(xì)胞免疫作用，可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞（Mφ）的吞噬功能，消除抑制性Mφ的抑制活性，還可選擇性地增強(qiáng)輔助性T淋巴細(xì)胞的增殖能力和活性[4-5]。由天津藥物研究院合成具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的TY501（11-脫氧甘草次酸-30-酰胺衍生物）為甘草次酸衍生物，具有甾體類似結(jié)構(gòu)，經(jīng)過前期一系列動(dòng)物體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有類似甾體類藥物（如潑尼松龍）的抗炎作用[6]；長期毒性研究未發(fā)現(xiàn)其有甾體類藥物（如潑尼松龍）的免疫抑制作用?，F(xiàn)通過小鼠灌胃給藥，研究TY501 對小鼠體重和中樞免疫器官胸腺、脾臟的影響，采用ADVIA 2120 血液分析儀測定小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量及比例，采用BD FACSAriaTMⅡ流式細(xì)胞儀測定藥物對小鼠外周血中淋巴細(xì)胞亞型的影響，探究并比較TY501 與潑尼松龍對免疫系統(tǒng)影響的差異。

1 儀器與試藥

1.1 試驗(yàn)藥物

TY501：白色粉末，含量為97.8%，批號(hào)為20100512，天津藥物研究院化學(xué)制藥研究部提供。試驗(yàn)前用精制玉米油配制成適當(dāng)濃度，供動(dòng)物灌胃給藥。

潑尼松龍：白色結(jié)晶粉末，含量98.2%，批號(hào)為PL100107，天津天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成適當(dāng)濃度，供動(dòng)物灌胃給藥。

1.2 動(dòng)物

ICR小鼠，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)小鼠體重均為18～22 g。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2006-0009。飼料為鼠專用全價(jià)營養(yǎng)塊料（天津市華榮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司生產(chǎn)）。動(dòng)物均飼養(yǎng)在有中央空調(diào)的觀察室，飲用動(dòng)物飲用水。

1.3 主要試劑及儀器

精制玉米油（華北制藥康欣有限公司生產(chǎn)，規(guī)格5 L/桶，批號(hào)：081203），羧甲基纖維素鈉300～800 M[國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，規(guī)格化學(xué)純（CP）500 g，批號(hào)：20081015]，染色檢測試劑 （PerCP Hamster Anti-Mouse CD3e；FITC Rat Anti-Mouse CD4；PE Rat Anti-Mouse CD8a；PerCP Hamster IgG1，k Isotype；FITC Rat IgG2，k Isotype Control；PE Rat IgG2a，k Isotype Control；PE Mouse Anti-Mouse NK1.1；FITC Rat Anti-Mouse CD19；PE Mouse IgG2a，k Isotype Control。所有染色試劑均為BD Pharmingen公司提供流式專用試劑），流式細(xì)胞儀專用鞘液 （BD FACSFlow鞘液，規(guī)格：20 L，批號(hào)：1015300043）。

電子天平[梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司，PL203]，電子天平[（美國雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司常熟雙杰測試儀器廠，T 2000）]，血液分析儀（Siemens Healthcare Diagnostics Inc，ADVIA 2120），流式細(xì)胞儀（bdbiosciences.com，BD FACSAriaTMⅡ）

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)5組，每組10只動(dòng)物，雌雄各半。分別為正常對照組、潑尼松龍組（15.0 mg/kg）、TY501 低劑量組（6.7 mg/kg）、T501 中劑量組（20.0 mg/kg）、TY501 高劑量組（60.0 mg/kg）。正常對照組給予動(dòng)物飲用水；潑尼松龍組灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉配制的濃度為0.75 mg/ml的混懸液；TY501低、中、高劑量組分別灌胃給予精制玉米油配制的濃度為0.33、1.00、3.00 mg/mL的混懸液。各組分別連續(xù)灌服相應(yīng)的藥物23 d， 給藥體積均為20 mL/kg。 于給藥后第 0、7、14、21天分別稱量動(dòng)物體重；末次給藥24 h后，用毛細(xì)管從眼眶靜脈叢采血，0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用ADVIA 2120 血液分析儀測定小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量及比例，采用流式細(xì)胞儀測定外周血中淋巴細(xì)胞亞型 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NK1.1 的比例；通過白細(xì)胞分類中淋巴細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞亞型的比例計(jì)算外周血中各淋巴細(xì)胞亞型的數(shù)量；稱量動(dòng)物體重，剖殺并稱取脾臟、胸腺，計(jì)算臟器指數(shù)。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 結(jié)果

2.3.1 對小鼠體重、胸腺、脾臟的影響 結(jié)果顯示，與正常對照組比較，給藥第7 天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，潑尼松龍組動(dòng)物體重明顯降低（P＜0.01 或P＜0.001）；TY501 各劑量對動(dòng)物體重未見明顯的變化。與正常對照組比較，潑尼松龍組小鼠脾臟、胸腺濕重及相應(yīng)系數(shù)明顯降低（P＜0.001），說明潑尼松龍對小鼠中樞免疫器官具有明顯的抑制作用；TY501 各劑量組小鼠脾臟、胸腺濕重及相應(yīng)系數(shù)未見明顯的變化，提示TY501 各劑量組未對小鼠中樞免疫器官起到明顯的抑制作用。見表1、2。

表1 不同給藥組對小鼠體重的影響（±s，g）

表1 不同給藥組對小鼠體重的影響（±s，g）

注：與正常對照組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別只數(shù) 給藥劑量（mg/kg） 第0 天 第7 天 第14 天 第21 天正常對照組潑尼松龍組TY501 低劑量組TY501 中劑量組TY501 高劑量組10 10 10 10 10-15.0 6.7 20.0 60.0 21.4 ±1.0 21.3 ±0.9 21.1 ±0.8 21.0 ±0.9 21.0 ±1.0 24.8 ±3.1 21.6 ±2.4**24.8 ±2.8 24.8 ±3.6 24.7 ±3.1 26.8 ±3.6 21.2 ±1.6***26.3 ±3.6 27.4 ±3.8 26.7 ±4.2 27.1 ±5.0 22.6 ±2.8**27.7 ±3.8 28.3 ±3.9 28.1 ±4.3

2.3.2 對小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)的影響 與正常對照組比較，潑尼松龍組白細(xì)胞總數(shù)未見明顯變化，淋巴細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.01），僅比正常對照組的50%略高，這與表2 得到的脾臟、胸腺重量及系數(shù)降低相一致；嗜中性粒細(xì)胞數(shù)明顯升高（P＜0.001），可能原因?yàn)閯?dòng)物由于免疫力下降存在隱性感染所致。TY501 低、中劑量組對小鼠白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)均未見明顯變化，未出現(xiàn)與潑尼松龍組相類似的使小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)顯著下降的影響；TY501 高劑量組白細(xì)胞數(shù)及嗜中性粒細(xì)胞數(shù)明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），可能是TY501 毒性反應(yīng)的結(jié)果。結(jié)果見表3。

表2 不同給藥組對小鼠脾臟、胸腺重量及系數(shù)的影響（±s）

表2 不同給藥組對小鼠脾臟、胸腺重量及系數(shù)的影響（±s）

注：與正常對照組比較，***P＜0.001

組別只數(shù) 給藥劑量（mg/kg） 脾濕重（g） 脾系數(shù)（g/g） 胸腺濕重（g） 胸腺系數(shù)（g/g）正常對照組潑尼松龍組TY501 低劑量組TY501 中劑量組TY501 高劑量組10 10 10 10 10-15.0 6.7 20.0 60.0 0.144 ±0.030 0.077 ±0.018***0.148 ±0.042 0.183 ±0.031 0.156 ±0.038 0.005 5 ±0.001 5 0.003 4 ±0.000 7***0.006 0 ±0.002 4 0.006 6 ±0.001 6 0.005 9 ±0.001 7 0.046 ±0.010 0.012 ±0.005***0.051 ±0.015 0.051 ±0.015 0.058 ±0.018 0.001 8 ±0.000 6 0.000 5 ±0.000 2***0.002 0 ±0.000 7 0.001 9 ±0.000 7 0.001 7 ±0.008 8

2.3.3 對小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞型的影響 與正常對照組比較，潑尼松龍組給藥后CD3+T總淋巴細(xì)胞和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.01 或P＜0.001），CD4+/CD8+比值顯著降低（P＜0.001），但結(jié)合給藥后淋巴細(xì)胞絕對數(shù)量計(jì)算T淋巴細(xì)胞及其各亞型的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，外周血中T總淋巴細(xì)胞絕對數(shù)量不僅沒有升高，反而降低，各亞型T淋巴細(xì)胞中又以CD3+CD4+數(shù)量減少為主，CD3+CD8+數(shù)量沒有明顯變化，CD3-CD19+淋巴細(xì)胞比例與數(shù)量均顯著降低（P＜0.001）（表5），說明潑尼松龍對小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫均有明顯的抑制作用。與正常對照組比較，TY501 中、高劑量組給藥后CD3-CD19+亞型淋巴細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），結(jié)合給藥后淋巴細(xì)胞絕對數(shù)量計(jì)算發(fā)現(xiàn)各組B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞數(shù)量增多，說明TY501 有增強(qiáng)體液免疫和非特異性免疫功能的趨勢；由于CD3-CD19+亞型淋巴細(xì)胞比例顯著升高致使CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞比例均有所降低（P ＜ 0.05或P＜0.01），CD4+/CD8+比值基本未有變化，結(jié)合給藥后淋巴細(xì)胞絕對數(shù)量計(jì)算T淋巴細(xì)胞的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，TY501 各劑量組給藥后T淋巴細(xì)胞數(shù)均沒有降低，反而有所升高， 但僅TY501 低劑量組和TY501 高劑量組的NK1.1 值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)果見表4、5。

表3 不同給藥組對小鼠外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響（±s，×109/L）

表3 不同給藥組對小鼠外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響（±s，×109/L）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別只數(shù) 給藥劑量（mg/kg） 白細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 嗜中性粒細(xì)胞正常對照組潑尼松龍組TY501 低劑量組TY501 中劑量組TY501 高劑量組10 10 10 10 10-15.0 6.7 20.0 60.0 4.46 ±1.91 4.65 ±1.60 5.79 ±1.50 4.97 ±1.57 7.11 ±2.64*2.94 ±1.45 1.62 ±0.38**3.89 ±1.34 3.50 ±1.34 4.51 ±2.77 0.92 ±0.44 2.46 ±1.19***1.32 ±0.78 0.98 ±0.37 2.02 ±1.14**

3 討論

本研究結(jié)果表明，潑尼松龍持續(xù)灌胃給藥21 d，對動(dòng)物中樞免疫器官的發(fā)育生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用，胸腺、脾萎縮，重量及指數(shù)顯著降低，外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，CD4+/CD8+比例顯著降低（P＜0.001）；CD3+CD8+亞型 T 細(xì)胞按其生物學(xué)功能又可分為抑制性細(xì)胞Ts或細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），其中Ts細(xì)胞可通過自身及分泌抑制因子在免疫反應(yīng)中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，抑制B細(xì)胞和CD3+CD4+細(xì)胞的功能，從而抑制抗體形成及細(xì)胞免疫反應(yīng)[7]。結(jié)合血液學(xué)測定儀和流式細(xì)胞儀測得的各亞型淋巴細(xì)胞的比例及計(jì)算各亞型淋巴細(xì)胞的數(shù)量結(jié)果顯示，CD3+CD4+亞型淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯降低（P＜0.05），B 淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.001），說明潑尼松龍對動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，尤其對體液免疫功能抑制作用更為顯著，這與有關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道相一致[8]。糖皮質(zhì)激素是強(qiáng)效的抗炎藥物，臨床上廣泛應(yīng)用，但由于其免疫抑制作用限制了它的臨床應(yīng)用。開發(fā)新型糖皮質(zhì)激素類藥物，在保留其抗炎活性的同時(shí)減少副作用尤為迫切，是近幾年來國內(nèi)外藥物學(xué)家一直致力于研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[9]。

表4 不同給藥組對小鼠外周血中各淋巴細(xì)胞亞型比例的影響（±s，%）

表4 不同給藥組對小鼠外周血中各淋巴細(xì)胞亞型比例的影響（±s，%）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別只數(shù) 給藥劑量（mg/kg） CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD4+/CD8+ CD3-CD19+ NK1.1正常對照組潑尼松龍組TY501 低劑量組TY501 中劑量組TY501 高劑量組10 10 10 10 10-15.0 6.7 20.0 60.0 52.3 ±5.9 61.9 ±8.6**47.3 ±11.1 44.9 ±7.5**45.9 ±6.9*40.5 ±4.9 39.4 ±6.9 35.4 ±8.0 33.8 ±5.4**31.3 ±10.3*9.1 ±1.9 18.3 ±4.9***7.9 ±2.4 7.7 ±2.3 7.2 ±1.4**4.6 ±1.0 2.3 ±0.6***4.3 ±1.5 4.7 ±1.2 4.7 ±1.0 29.2 ±5.7 8.3 ±3.8***32.3 ±13.1 38.3 ±7.7**35.3 ±6.1*3.9 ±1.1 7.7 ±3.3**4.5 ±2.3 4.1 ±1.4 5.3 ±1.9*

表5 不同給藥組對小鼠外周血中各淋巴細(xì)胞亞型數(shù)量的影響（±s，×109/L）

表5 不同給藥組對小鼠外周血中各淋巴細(xì)胞亞型數(shù)量的影響（±s，×109/L）

注：與正常對照組比較：*P＜0.05，***P＜0.001

組別只數(shù) 給藥劑量（mg/kg） CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3-CD19+ NK1.1正常對照組潑尼松龍組TY501 低劑量組TY501 中劑量組TY501 高劑量組10 10 10 10 10-15.0 6.7 20.0 60.0 1.57 ±0.84 1.01 ±0.30*1.84 ±0.64 1.81 ±0.64 2.14 ±1.29 1.22 ±0.67 0.64 ±0.20*1.30 ±0.59 1.36 ±0.50 1.61 ±0.99 0.27 ±0.13 0.30 ±0.12 0.30 ±0.15 0.31 ±0.12 0.37 ±0.26 0.83 ±0.47 0.12 ±0.05***1.33 ±0.63 1.54 ±0.57 1.43 ±0.90 0.11 ±0.07 0.13 ±0.07 0.21 ±0.08*0.18 ±0.10 0.18 ±0.07*

TY501 持續(xù)灌胃給藥21 d，對小鼠中樞免疫器官、外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量及比例、淋巴細(xì)胞亞型等均未產(chǎn)生抑制作用。甘草酸和甘草次酸是甘草中含量最高的苷類化合物，也是甘草的主要甜味成分[10]。TY501 為甘草次酸衍生物，具有甾體類似結(jié)構(gòu)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明劑量為6.0 mg/kg時(shí)TY501 對冰醋酸致炎性滲出、角叉菜膠性足腫等小鼠急性炎癥具有最佳抗炎作用；在0.33 mg/kg時(shí)多次給藥對慢性炎癥模型大鼠棉球肉芽腫即有顯著的抑制作用，其抗炎作用與潑尼松龍相當(dāng)（本課題組藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)表資料）。與甾體類藥物（潑尼松龍）相比，TY501 在保留了相當(dāng)強(qiáng)的抗炎活性的同時(shí)，對小鼠免疫系統(tǒng)未發(fā)現(xiàn)明顯的抑制作用，使其有望進(jìn)一步被開發(fā)成為有鮮明特色的抗炎藥物。

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