苗玉發(fā)，周曉冰，霍 艷，汪巨峰，李 波

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100176)

大鼠尿中酶類參考值檢測

苗玉發(fā)，周曉冰，霍 艷，汪巨峰，李 波

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100176)

目的 調(diào)查正常大鼠尿液樣本中酶類參考值范圍。方法 采集95只正常SD大鼠的4 h尿液，用生化儀檢測尿液中的N－乙酰基－β－D氨基葡萄糖酶(NAG)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰氨基轉(zhuǎn)移酶(γ－GT)和乳酸脫氫酶(LDH)的值，參考范圍以95%百分位上界表示。結(jié)果 參考值范圍為，雌性:NAG＜5.3 U/L，ALP＜110.8 U/L，γ－GT ＜753.0 U/L，LDH ＜32.6 U/L;雄性:NAG ＜27.3 U/L，ALP ＜329.0 U/L，γ－GT ＜769.8 U/L，LDH ＜40.0 U/L。以/g Cre為單位的參考值范圍，雌性:NAG ＜28.9 U/g，ALP ＜723.5 U/g，γ－GT ＜1763.2 U/g，LDH ＜113.1 U/g;雄性:NAG ＜84.3 U/g，ALP ＜680.2 U/g，γ－GT ＜2522.3 U/g，LDH ＜121.8 U/g。結(jié)論 尿中酶類參考值范圍為藥物腎毒性評價提供了背景數(shù)據(jù)。

尿酶;大鼠;參考范圍

目前大鼠尿液中的酶類已發(fā)現(xiàn)有40多種，其來源主要有3個途徑:血漿的尿酶有堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)等;腎小管上皮細(xì)胞分泌的酶有谷氨酰氨基轉(zhuǎn)移酶(γ－GT)和丙氨酸氨基肽酶(AAP)等;溶酶體的酶有N－乙酰基－β－D氨基葡萄糖酶(NAG)，溶菌酶(Lys)和 β－半乳糖苷酶(GAL)等。這些酶類作為腎臟損傷的生物標(biāo)志物，在人體臨床診斷中應(yīng)用廣泛。然而，在臨床前藥物安全性評價中，腎毒性評價常用的指標(biāo)為血肌酐、血尿素氮、血尿酸、尿干化學(xué)和尿中有形成份等，很少有關(guān)于尿中酶類標(biāo)志物的測定和評價的報道。隨著非臨床腎毒性研究的深入，尿酶生物標(biāo)志物必將納入評價的指標(biāo)。本文主要調(diào)查大鼠尿中幾種常用酶類的參考范圍，為將來的非臨床腎毒性評價提供背景數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

5～7周齡的 SD大鼠，雌性47只，雄性48只，來自毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中對照組動物，購自中國食品藥品檢定研究院動物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號:SCXK(京)2009－0017。尿液為4 h內(nèi)新鮮尿液，用自制大鼠代謝籠收集。

1.2 儀器和方法

儀器為Hitachi 7060，試劑及校準(zhǔn)品均購自和光純藥株式會社。高、低值質(zhì)控品，BioRad，批號:45611和45612。肌酐(Cre)測定方法為酶法，NAG、ALP、LDH、γ－GT 為 Wako L－type 速率法 (37℃)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Kolmogorov－Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性。當(dāng)數(shù)據(jù)分布呈正態(tài)時，計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)差，參考范圍以單側(cè)95%可信區(qū)間表示。當(dāng)數(shù)據(jù)分布不呈正態(tài)時，描述四分位數(shù)(P25，P50和P75)，參考范圍以第95百分位數(shù)(P95)作為上限。

2 結(jié)果

各酶指標(biāo)的測定結(jié)果見表1。正常大鼠尿中酶類參考值范圍為，雌性:NAG＜5.3 U/L，ALP＜110.8 U/L，γ－GT ＜753.0 U/L，LDH ＜32.6 U/L;雄性:NAG ＜ 27.3 U/L，ALP ＜ 329.0 U/L，γ－GT ＜769.8 U/L，LDH＜40.0 U/L。以/g Cre為單位的參考值范圍，雌性:NAG ＜28.9 U/g，ALP ＜723.5 U/g，γ－GT ＜1763.2 U/g，LDH ＜113.1 U/g;雄性:NAG ＜84.3 U/g，ALP ＜ 680.2 U/g，γ－GT ＜ 2522.3 U/g，LDH ＜121.8 U/g。

3 討論

尿酶的種類較多，主要來源于腎臟，極少數(shù)來自血液，大多數(shù)分子量 ＞70 kDa。當(dāng)腎臟損傷時，細(xì)胞中的酶類釋放增加，尿中酶活性升高，因此尿酶可以作為提示腎細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物。NAG是一種溶酶體酶，分子量約130～140 kDa，廣泛分布于人體各組織，以前列腺和近端腎小管中含量最多。正常尿液中排出的NAG量相對固定，當(dāng)腎實(shí)質(zhì)性損傷尤其是近曲小管損傷時，NAG排出增加，可以作為腎小管損傷評價的靈敏標(biāo)志物［1］。

γ－GT是廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜中的一種酶，分子量90～120 kDa，以腎臟中分布最多。腎組織中又以近端腎小管和Henle袢的刷狀緣中含量最多。腎臟損傷后，尿中γ－GT升高明顯，因此 γ－GT可作為泌尿系統(tǒng)損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)。在一篇臨床研究報道中，嬰幼兒感染巨細(xì)胞病毒后，活動性感染組患兒尿中γ－GT和NAG水平顯著性升高，提示感染患兒的腎小管已經(jīng)受損，為早期發(fā)現(xiàn)腎小管損傷和及時治療提供了依據(jù)［2］。

表1 正常大鼠尿中酶類的測定結(jié)果Tab.1 Measurements of urinary enzymes in the normal rats

正常動物尿液中ALP主要來源于腎小管上皮細(xì)胞，當(dāng)腎小管濾過功能障礙和腎小管上皮細(xì)胞損傷時，尿ALP升高。此標(biāo)志物可以作為腎毒性損傷的早期診斷指標(biāo)。但是ALP特異性較低，只能作為近端腎小管損害的補(bǔ)充標(biāo)志物。LDH廣泛存在于各種器官、組織細(xì)胞和體液中。在腎臟中，LDH主要存在于腎小管上皮細(xì)胞。腎臟急性損傷時，腎小管上皮細(xì)胞受損，細(xì)胞內(nèi)的 LDH釋放到腎小管腔中，使尿中LDH酶活性升高，可以作為腎實(shí)質(zhì)性病變的重要標(biāo)志物。

在實(shí)際應(yīng)用中，尿酶常和微量白蛋白聯(lián)合用于腎毒性評價。微量白蛋白分子量較小，當(dāng)腎小球受到損傷時，可通過腎小球滲透到腎小管中，而腎小管對微量白蛋白幾乎無重吸收作用，導(dǎo)致尿液中的微量白蛋白升高，此指標(biāo)是評價腎小球功能的敏感指標(biāo)。測定人尿中微量白蛋白有多種方法，比如散射比濁法、透射比濁法、膠體金法、放射免疫法和化學(xué)發(fā)光免疫法等，然而目前商業(yè)化的產(chǎn)品只有酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)一種方法可用于大鼠尿中微量白蛋白的測定［3］。相比于自動生化分析儀采用的比濁法，ELISA方法具有操作繁瑣、耗時、成本高等特點(diǎn)，因此，本研究中未對大鼠尿液中的微量白蛋白背景值進(jìn)行測定，有待于在以后腎毒性評價時用ELISA方法進(jìn)行檢測。

通過分析發(fā)現(xiàn)尿酶數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，數(shù)據(jù)離散度較大，特別是ALP和γ－GT，即使經(jīng)Cre校正后，其離散度仍然較大，這很可能是個體間差異引起的。尿酶活性的增加，提示腎臟的細(xì)胞損傷，這種損傷可能是一過性的、可逆性的，未必造成嚴(yán)重的腎損傷。因此，在腎毒性評價中，要結(jié)合尿酶的動態(tài)監(jiān)測數(shù)據(jù)來綜合判斷。盡管如此，本研究中獲得的尿酶參考范圍為將來在大鼠中評價腎臟毒性提供了重要的背景數(shù)據(jù)。

［1］呂春，陳江林，聶宇波.尿蛋白聯(lián)合尿酶、血磷輔助檢查檢測對早期腎損傷的臨床應(yīng)用［J］.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，28(6):820－821.

［2］鄭曉群，喬增培，余堅(jiān)，等.巨細(xì)胞病毒感染患兒尿微量蛋白及尿酶檢測的意義［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2010，28(4):289－290.

［3］Liu R，Li G，Cui XF，et al..Methodological evaluation and comparison of five urinary albumin measurements［J］.J Clin Lab Anal，2011，25(5):324－325.

Investigation of Reference Ranges of Urinary Enzymes in Rats

MIAO Yu－fa，ZHOU Xiao－bing，HUO Yan，WANG Ju－feng，LI Bo
(National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100176，China)

Objective To investigate the reference range of enzymes in urine samples of normal rats.Methods Four－h(huán)our urine samples were collected from 95 normal rats.Urinary enzymes including NAG，ALP，γ－GT，LDH were analyzed using a biochemical analyzer.Reference ranges were shown with upper 95th percentile.Results The reference ranges for female rats:NAG ＜5.3 U/L，ALP ＜110.8 U/L，γ－GT ＜753.0 U/L，LDH ＜32.6 U/L;for male:NAG ＜27.3 U/L，ALP ＜329.0 U/L，γ－GT ＜769.8 U/L，LDH ＜40.0 U/L.Reference ranges using the unit/g·Cre for female:NAG ＜28.9 U/g，ALP ＜723.5 U/g，γ－GT ＜1763.2 U/g，LDH ＜113.1 U/g;for male rats:NAG ＜84.3 U/g，ALP ＜680.2 U/g，γ－GT ＜2522.3 U/g，LDH ＜ 121.8 U/g.Conclusion The reference ranges of urinary enzymes may provide background values for renal toxicity evaluation in the future.

Urinary enzymes;Rat;Reference range

R33

A

1671－7856(2012)08－0026－03

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.006

2012－05－08

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09302001)。

苗玉發(fā)(1980－)，男，助理研究員，碩士，主要從事食品藥品安全性研究，E－mail:miaoyufa@nifdc.org.cn。

李波，研究員，主要從事食品藥品檢定.Email:libo@nifdc.org.cn。