梁麗琴 魏學(xué)智 段江燕 張曉俊 安 娜

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾 041004)

蛋白質(zhì)是供給必需的氨基酸以維持生理健康的重要物質(zhì)，隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展及生活水平的提高，全球蛋白質(zhì)資源緊缺現(xiàn)象日益嚴(yán)重。動(dòng)物蛋白生產(chǎn)成本較高，且含有膽固醇，不適于高血壓及心臟病等病人。植物蛋白營(yíng)養(yǎng)豐富，必需氨基酸組成與比例均優(yōu)于動(dòng)物蛋白，尤其是它不含膽固醇，因而深受食品科學(xué)家的青睞。近年來(lái)，農(nóng)產(chǎn)品價(jià)格不斷上漲，其中豆類(lèi)產(chǎn)品價(jià)格的上漲使得種子蛋白的生產(chǎn)加工成本也逐漸提高。而植物葉蛋白資源豐富，其必需氨基酸的數(shù)量和比例均優(yōu)于大豆餅蛋白［1］，因而開(kāi)發(fā)植物葉蛋白具有重要意義。

扁核木(Prinsepia uniflora Batal)為薔薇科扁核木屬的落葉灌木，在山西、陜西、內(nèi)蒙古、東北等地均有分布。扁核木枝繁葉茂，果實(shí)可以食用，種子可以榨油也可以入藥，因而在生產(chǎn)、生態(tài)和造景觀(guān)賞方面均有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景［2］。目前，有關(guān)扁核木的開(kāi)發(fā)研究主要集中在育種栽培方面，而關(guān)于扁核木的果實(shí)及葉的開(kāi)發(fā)研究未見(jiàn)報(bào)道。因而，本試驗(yàn)將對(duì)扁核木葉蛋白的提取方法進(jìn)行研究。傳統(tǒng)的酸加熱法提取葉蛋白效率低，純度低，且耗時(shí)。酶法雖然可以提高效率，但酶價(jià)格昂貴，易失活，提取過(guò)程也較難控制。超聲波能夠產(chǎn)生增溶作用［3］，提取效率高，提取時(shí)間短，且其成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作容易，現(xiàn)已被用于大豆蛋白［4－6］、玉米醇溶蛋白［7］、蕎麥蛋白［8］、棉籽蛋白［9］、小麥胚芽蛋白［10］及花生蛋白［11］等的輔助提取，因此，本試驗(yàn)將探討超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白，以期為扁核木葉蛋白的食品開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

扁核木葉:采自山西臨汾龍寺鎮(zhèn);所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS－3C酸度計(jì)、HJ－6A數(shù)顯多頭磁力恒溫?cái)嚢杵?金壇市榮華儀器制造有限公司;HAP－300超聲波處理儀:寧波新芝生物科技股份有限公司;LG－24A型高速離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng);LG10－2.4A型高速冷凍離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州國(guó)華電器有限公司;UV－7504c紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海欣茂儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 扁核木葉的處理

取新鮮的無(wú)病蟲(chóng)害扁核木葉，放于潔凈的培養(yǎng)皿中，用自來(lái)水沖洗3次后，再用蒸餾水洗3次，用濾紙吸去多余水分。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g扁核木葉，將其剪成0.5 cm長(zhǎng)的小段，加石英砂充分研磨后，加入50 mL pH 3.6的磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻后于40℃下超聲波提取30 min，然后在4 000 r/min離心20 min，取上清液并測(cè)定體積，取部分上清液進(jìn)行半微量凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，剩余上清液用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。用考馬斯亮藍(lán)法在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定提取液的吸光度Y［12］。以提取液蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)X，吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，最小二乘法擬合得方程:

1.3.3 扁核木葉蛋白的酸加熱提取及超聲波輔助提取方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g新鮮的扁核木葉，將其剪成0.5 cm長(zhǎng)的小段，加石英砂充分研磨，按一定液料比加入一定溫度下預(yù)熱的pH磷酸鹽緩沖液，在一定溫度下攪拌一定時(shí)間(超聲波處理，功率為50 W)，4 000 r/min離心15 min，再將離心液用快速濾紙過(guò)濾除去漂浮物，定容至30 mL，用考馬斯亮藍(lán)法595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定濾液的吸光值，并計(jì)算扁核木葉蛋白含量［13］。

1.3.4 扁核木葉蛋白提取率計(jì)算［8］

1.3.5 扁核木葉基本化學(xué)成分測(cè)定［14］

蛋白質(zhì)含量測(cè)定:凱氏定氮法測(cè)定。粗脂肪含量測(cè)定:索氏抽提法。水分測(cè)定:常壓烘干法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，正交試驗(yàn)結(jié)果采用極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 扁核木葉基本化學(xué)成分

由表1可知，扁核木葉蛋白占葉片鮮重的5.36%。據(jù)資料報(bào)道［15］，葉蛋白主要包括溶解性好的細(xì)胞質(zhì)蛋白和葉綠體內(nèi)基質(zhì)蛋白、線(xiàn)粒體蛋白、難溶的葉綠體結(jié)構(gòu)蛋白、線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)蛋白、核蛋白及細(xì)胞壁蛋白、另外還有脫氫酶過(guò)氧化物酶及多酚氧化酶等多種酶組成的蛋白質(zhì)混合體。其中，核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶占細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)的70%～80%。

表1 扁核木葉基本化學(xué)成分/%

2.2 處理時(shí)間對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響

設(shè)定液料比1∶10，pH 3.6，溫度40 ℃為不變因素，處理時(shí)間分別為 10、20、30、40、50 min，時(shí)間對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響如圖1。

由圖1可知，處理時(shí)間在10～50 min之內(nèi)，用超聲波輔助酸溶法提取扁核木葉蛋白，其提取率均遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的酸溶法。在處理時(shí)間為10～20 min之間，用超聲波輔助法提取時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，扁核木葉蛋白的提取率與時(shí)間呈正相關(guān)，超過(guò)20 min后，提取率增加不再明顯，且逐漸趨于穩(wěn)定。這可能是由于在10～20 min之內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，形成的氣泡逐漸增多，高頻振蕩逐漸劇烈，吸收的聲能逐漸增大，破壁的效果逐漸增強(qiáng)，蛋白質(zhì)溶出也逐漸增多。而超過(guò)20 min后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率反而不斷下降，這可能是由于超聲波的強(qiáng)烈振動(dòng)及熱效應(yīng)作用導(dǎo)致蛋白變性，從而使葉蛋白水溶性變差。

圖1 處理時(shí)間對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響

2.3 溫度對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響

設(shè)定液料比1∶10，pH 3.6，處理時(shí)間30 min 為不變因素，溫度分別為30、35、40、45、50 ℃，溫度對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響如圖2。

圖2 溫度對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響

由圖2可知，在30～45℃之間，隨著溫度的升高，扁核木葉蛋白的提取率也逐漸增加，當(dāng)溫度為45℃時(shí)，無(wú)論是傳統(tǒng)的酸加熱法還是加以超聲波輔助，葉蛋白的提取率均最高，此時(shí)，用超聲波輔助酸溶法提取葉蛋白的提取率可達(dá)85.72%。當(dāng)溫度超過(guò)45℃時(shí)，葉蛋白提取率開(kāi)始下降，這可能是由于此時(shí)蛋白質(zhì)開(kāi)始變性，蛋白質(zhì)分子展開(kāi)導(dǎo)致疏水基團(tuán)的暴露及蛋白質(zhì)分子相互纏繞，從而使溶解度降低。整體看來(lái)，不同溫度下，用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的提取率也均高于傳統(tǒng)的酸加熱法的提取率。

2.4 液料比對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響

設(shè)定pH 3.6，溫度40℃，處理時(shí)間30 min為不變因素，液料比分別為 6、8、10、12、14，液料比對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響如圖3。

圖3 液料比對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響

由圖3可知，在液料比為6～14之間時(shí)，隨著液料比的增加，提取率逐漸增高，當(dāng)液料比為12時(shí)，扁核木葉蛋白的提取率達(dá)到最高，當(dāng)液料比超過(guò)12時(shí)，葉蛋白的提取率趨于穩(wěn)定，說(shuō)明此時(shí)蛋白質(zhì)已被最大程度的溶解出來(lái)。整體看來(lái)，在不同液料比下，用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的提取率也均遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的酸加熱法的提取率。

2.5 pH對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響

設(shè)定液料比1∶10，溫度40℃，處理時(shí)間30 min為不變因素，pH 分別為 3.0、3.6、4.2、4.8、5.4，pH對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響如圖4。

圖4 pH對(duì)扁核木葉蛋白提取率的影響

由圖4可知，在pH 3.0～5.4之間，扁核木葉蛋白的提取率與pH呈負(fù)相關(guān)，在pH為3.0時(shí)扁核木葉蛋白提取率最高。當(dāng)提取液pH逐漸增大時(shí)，扁核木葉蛋白的提取率也逐漸下降。這是由于蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)，當(dāng)溶液pH小于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，酸性溶液中大量的氫離子使蛋白質(zhì)氫離子化而帶有大量正電荷，這些帶有正電荷的基團(tuán)會(huì)與周?chē)芤褐械乃肿影l(fā)生結(jié)合，在蛋白質(zhì)周?chē)纬梢粚铀瘜樱瑥亩沟玫鞍踪|(zhì)更穩(wěn)定的存在于溶液中，即增加了蛋白質(zhì)的溶解度。在pH 3.0～5.4酸性范圍內(nèi)，扁核木葉中的蛋白質(zhì)帶有正電荷，且隨著pH的逐漸增大，葉蛋白質(zhì)所帶正電荷逐漸減少，蛋白質(zhì)的溶解度也逐漸降低。整體看來(lái)，在pH 3.0～5.4之間，用超聲波輔助酸溶法提取扁核木葉蛋白的提取率也均遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的酸加熱法的提取率。

2.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以節(jié)約生產(chǎn)成本為原則，對(duì)溫度、時(shí)間、pH、液料比4個(gè)因素各取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以扁核木葉蛋白的提取率為指標(biāo)，探索酸加熱法及超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳提取條件。正交試驗(yàn)因素－水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析見(jiàn)表3。

通過(guò)表3極差分析結(jié)果可知，酸溶法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝為A3B3C1D2，即時(shí)間25 min、溫度45℃、液料比8、pH 3.6，各因素對(duì)扁核木葉蛋白提取率影響的顯著次序?yàn)锳＞C＞D＞B，即時(shí)間＞液料比＞pH＞溫度;超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝為B＞C＞D＞A，即時(shí)間20 min、溫度40℃、液料比12、pH4.2，各因素對(duì)扁核木葉蛋白提取率影響大小的次序?yàn)锽＞C＞D＞A，即:溫度＞液料比＞pH＞時(shí)間。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用上述最佳工藝條件分別進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)測(cè)得用酸加熱法提取扁核木葉蛋白，其提取率為70.37%，用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白，其提取率為87.90%，超聲波輔助酸加熱法較傳統(tǒng)的酸加熱法提取扁核木葉蛋白的提取率提高了17.53%。

2.8 酸沉淀扁核木葉蛋白

用0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)扁核木葉蛋白超聲波提取液至 pH 5.4，4 000 r/min 離心 15 min，脂肪、葉綠素、糖類(lèi)及有機(jī)物等雜質(zhì)留于上清液中，去上清液，沉淀則為純化的扁核木葉蛋白。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

3 結(jié)論

3.1 采用酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝條件:時(shí)間 25 min、溫度 45 ℃、液料比 8、pH 3.6，此時(shí)，扁核木葉蛋白的提取率為70.37%。

3.2 采用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝條件:時(shí)間20 min、溫度40℃、液料比12、pH 4.2，此時(shí)，扁核木葉蛋白的提取率為87.9%。

3.3 相對(duì)于傳統(tǒng)的酸溶法，用超聲波輔助酸溶法提取扁核木葉蛋白，節(jié)省了時(shí)間，降低了溫度，并增大了pH，這大大降低了生產(chǎn)成本。

3.4 采用超聲波輔助酸溶法提取可以提高扁核木葉蛋白的提取率，與單純酸溶法提取法相比，扁核木葉蛋白提取率提高了17.53%。

3.5 將扁核木葉蛋白超聲波提取液調(diào)至pH 5.4，對(duì)扁核木葉蛋白進(jìn)行酸沉淀，可將扁核木葉蛋白從提取液中分離出來(lái)。

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