李博文，李明濤，柏會文，劉玉芬

(哈爾濱師范大學(xué))

0 引言

甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)，是由肝細(xì)胞合成并分泌入血的一種天然免疫因子，屬C型凝集素(Ca2+依賴型)超家族，被認(rèn)為是非免疫宿主體內(nèi)最重要的一線抗感染免疫分子［1］.MBL肽鏈有4個(gè)功能區(qū)域:一個(gè)富含半胱氨酸的N末端區(qū)、膠原樣區(qū)(collagenlike region，CLR)、頸區(qū)和 C末端糖基識別域(carbohydrate-recognition domain，CRD).CRD是MBL的識別功能區(qū)，在Ca2+的參與下，CRD特異性地與多種細(xì)菌、病毒、惡性細(xì)胞表面具有的以甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、巖藻糖等糖類等為末端糖基的糖結(jié)構(gòu)結(jié)合，通過CLR區(qū)而發(fā)揮效應(yīng)［2］.牛MBL作為機(jī)體的一種天然免疫因子，在牛的天然防御過程中發(fā)揮著重要的作用，但是目前對于該因子結(jié)構(gòu)的研究資料較少，本研究將對該分子的CRD區(qū)進(jìn)行分析，為牛MBL-A的分子應(yīng)用提供鋪墊.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

新鮮牛肝臟組織

1.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中MBL-A的cDNA基因序列 (登錄號:BC109674)，采用 Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)一對特異引物，引物序列為正向引物5’-AGAAGCTGTATGTGACCAATCG-3’，反向引物5’-CAGAGCAGCAGGGAGACACT-3’，委托上海生工生物工程有限公司合成.

1.1.3 主要試劑與工具酶

AMV第一鏈cDNA合成試劑盒、UNIQ-10柱式膠回收試劑盒;TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、pMD18-T載體均購自上海生工生物工程有限公司.其它相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 肝臟總RNA的提取

取牛新鮮肝臟組織0.5 g，用液氮迅速研磨成粉末狀，加入 700μL SDS緩沖液，350μL Tris酚，350 μL 氯仿，100 μL β -巰基乙醇，用漩渦振蕩器劇烈震蕩 10 min，14000 rpm、4℃離心10 min.取上清，加入等體積酚∕氯仿，劇烈震蕩5 min，14000rpm、4 ℃離心5 min，重復(fù)一次.取上清，加入等體積氯仿(氯仿∶異戊醇=24∶1)，劇烈震蕩5 min，14000 rpm、4℃離心 5 min.取上清，加入等體積氯化鋰∕無水乙醇(1∶1)，-20℃沉淀10 min，12000 rpm、4℃離心 15 min.再用適量DEPC水溶液(20～30μL)溶解，加入1/10體積β-巰基乙醇，溶解后電泳檢測.

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增牛MBL-A的CRD區(qū)

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供的方法，將牛肝臟總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng).建立10μL反應(yīng)體系，依次分別加入 ddH2O 7.3 μL，10 ×Buffer 1.0μL，dNTP 2.0μL，cDNA 1.0 μL，Taq 酶0.1μL，上、下游引物各 0.4μL.擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min.反應(yīng)后電泳檢測并進(jìn)行結(jié)果判斷.

1.2.3 目的基因片段與T-載體的連接

PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化回收后，通過T/A克隆的方法，直接與pMD18-T載體連接，連接反應(yīng)體系如下:純化回收的PCR產(chǎn)物4.5 μL、Ligation SolutionⅠ5μl、pMD18-T Vector DNA 0.5μL，混勻后16 ℃連接過夜.

1.2.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

取一管100 μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入全部的連接產(chǎn)物10 μL混勻;置于冰上 30 min，42℃熱休克1 min;加入1 mL LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)大約1 h;將全部菌液進(jìn)行無菌涂板，37℃過夜培養(yǎng).

1.2.5 菌落PCR鑒定與菌種保存

以轉(zhuǎn)化菌的單個(gè)克隆為模板，其余條件與1.2.2一致，鑒定和篩選陽性轉(zhuǎn)化菌.選擇5個(gè)陽性單菌落挑入同一平板中，37℃過夜培養(yǎng);挑陽性單菌落于 LB培養(yǎng)基中，加入氨芐(100 μL∕100 mL)，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)過夜;取菌液700 μL 加入 1.5 mL eppendorf管，同時(shí)加入700μl、30%甘油，封口，-80℃保存.

1.2.6 牛MBL-A基因CRD區(qū)的序列測定

委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定.

2 結(jié)果

2.1 牛肝臟組織總RNA的提取

經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測后，呈現(xiàn)出兩條清晰的條帶(如圖1).由上至下，第一條為28S的RNA，第二條為18S的RNA，兩條帶的亮度比為2∶1.該結(jié)果表明采用SDS法能夠從動物的肝臟組織中提取出RNA，且完整性較好.

圖1 肝臟組織中總RNA

2.2 牛MBL-A基因CRD區(qū)的擴(kuò)增

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，獲得包括MBL-A基因CRD區(qū)的目的產(chǎn)物，引物跨度大約380 bp，電泳中顯示清新的目的條帶(如圖2).

圖2 MBL-A CRD的PCR擴(kuò)增鑒定

2.3 陽性菌株的鑒定

菌落PCR將分離培養(yǎng)的菌體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到特異性目的條帶，證實(shí)為陽性陽性轉(zhuǎn)化菌(如圖3).

圖3 菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M.DL2 000 M arker.其余均為MBL-A CRD的菌落PCR目的條帶

2.4 牛MBL-A基因CRD區(qū)的序列測定

測序結(jié)果表明，MBL-A基因CRD編碼區(qū)全長375bp，編碼125個(gè)氨基酸殘基.

3 討論

該研究根據(jù)NCBI公布的MBL-A基因的全長cDNA序列，通過RT-PCR技術(shù)從牛肝臟總RNA中克隆出MBL-A基因的CRD片段，該片段長375 bp.CRD是MBL識別配體-糖結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，既可以結(jié)合單糖成分(與之親和性較差)又可以結(jié)合多糖成分(顯示出高親和性)［3］.結(jié)果表明，該片段含125個(gè)氨基酸殘基，具有4個(gè)Cys殘基和18個(gè)保守殘基，這些氨基酸殘基可以形成2個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵和2個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，使肽段折疊形成球形CRD，并以這種形式發(fā)揮其生理效應(yīng)［4］.與Genbank上發(fā)表的其他一些參考物種的核苷酸和氨基酸序列相比，與參考物種MBL-A基因CRD的親緣關(guān)系較近，與MBL-C較遠(yuǎn)［5］;與豬、恒河猴的親緣關(guān)系非常近，與大鼠、小鼠親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與禽類關(guān)系更遠(yuǎn).

甘露聚糖結(jié)合凝集素作為天然免疫的重要組成部分，其功能的發(fā)揮主要依賴糖識別域.因此，研究MBL分子CRD的生物信息學(xué)特征，對進(jìn)一步研究CRD的識別效應(yīng)，進(jìn)而闡明MBL介導(dǎo)的天然免疫防御功能具有重要意義;同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)以牛MBL-A基因?yàn)檠芯繉ο?，也為選育具有高抗病性的牛品種提供了理論依據(jù).

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