張春梅，宋 海，魏生龍

（1.河西學(xué)院食用菌研究所，甘肅 張掖 734000；2.河西學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 張掖 734000；3.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

荷葉離褶傘 Lyophyllum decastes，隸屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目、口蘑屬、離褶傘屬食用真菌[1]，味道鮮美，屬野生優(yōu)良食用菌[2]。李林玉等探討了荷葉離褶傘生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)條件[3]，魏生龍等報(bào)道了荷葉離褶傘分離馴化[4]和生物學(xué)特性研究[5]，該菌種保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”（保藏號(hào) CGMCC 1518，菌株號(hào)ZY48－1），該菌種于2008年獲得了國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利授權(quán)[6]。關(guān)于食用真菌多糖提取工藝的研究很多，傳統(tǒng)工藝有熱水浸提法、稀酸浸提法、稀堿浸提法等，新工藝包括酶法、超聲波輔助法、微波輔助浸提法、超濾法等[7]，其中熱水浸提法為食用菌多糖最經(jīng)典的提取方法，以其工藝簡(jiǎn)單、成本低、易于推廣等特點(diǎn)為人們所接受。此前對(duì)荷葉離褶傘菌絲體多糖提取工藝方面的研究報(bào)道極少，而其水溶性多糖抗氧化性能的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)荷葉離褶傘多糖提取工藝進(jìn)行研究，得到一種優(yōu)化方案，并以還原力為依據(jù)，研究了荷葉離褶傘多糖的抗氧化活性，為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用以及天然保健品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

荷葉離褶傘由河西學(xué)院食用菌研究所提供，菌種保藏號(hào) CGMCC NO.1518，菌種編號(hào) ZY48-1，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00510096405.0，公開(kāi)號(hào)CN1923997A。

1.1.2 液體菌種培養(yǎng)基配方

將玉米面加水調(diào)制成懸液，加入0.1%淀粉酶，于70℃水浴鍋中酶解5 h；大豆先用水浸泡24 h，用豆?jié){機(jī)打漿，加入0.1%蛋白酶，于55℃水浴鍋中酶解5 h。然后用300目篩過(guò)濾，濾液中加入白糖，加水定容。

1.1.3 液體菌種培養(yǎng)

將供試試管菌種置于22℃恒溫箱內(nèi)活化24 h，接入250 mL三角瓶（100 mL）中，置于 22℃、轉(zhuǎn)速 120 r·min-1的恒溫?fù)u床上，連續(xù)培養(yǎng)7 d。將該菌種接入20 L液體菌種培養(yǎng)罐中，接種量10%，恒溫22℃、通氣量20 L·h-1，連續(xù)培養(yǎng)7 d獲得液體菌種。

1.1.4 發(fā)酵罐發(fā)酵

將液體菌種按10%的接種量接入200 L發(fā)酵罐中，給予攪拌轉(zhuǎn)速 160 r·min-1、罐壓 0.2 MPa、通氣量 80 L·h-1、pH 6.5、溫度20℃的培養(yǎng)條件，連續(xù)培養(yǎng)8 d。

1.2 儀器與設(shè)備

DFT-50流水式中藥粉碎機(jī)，青州三陽(yáng)包裝設(shè)備有限公司；UV-9100分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵、KQ-B玻璃儀器氣流烘干器，鞏義市予華儀器有限公司；RE-85C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海青浦滬西儀器廠(chǎng)；HK-2A超級(jí)恒溫水浴鍋，江蘇金壇市中大儀器廠(chǎng)；DHG-9070(A)電熱干燥箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；AR1530電子精密天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；苯酚、濃硫酸、正丁醇、氯仿、95%乙醇、無(wú)水乙醇、三氯乙酸、抗壞血酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗多糖浸提過(guò)程中的單因素試驗(yàn)

選擇原料的粉碎度（目數(shù)），浸提過(guò)程中的料水比、溫度、時(shí)間，醇沉?xí)r的乙醇添加倍數(shù)、提取次數(shù)為因素，研究各因素下浸提液中的粗多糖得率。

1.3.2 粗多糖浸提過(guò)程中最佳工藝條件的確定

在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)以?xún)?yōu)化荷葉離褶傘多糖提取工藝。選擇提取時(shí)間、料水比、提取溫度、乙醇濃度四個(gè)對(duì)多糖提取影響較大的因素，按L9(34)設(shè)計(jì)四因素、三水平的正交試驗(yàn)，以?xún)?yōu)化浸提過(guò)程的工藝條件。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，取各提取率的平均值。

1.3.3 粗多糖浸提最佳工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)確定的最佳工藝條件下進(jìn)行試驗(yàn)，以驗(yàn)證粗多糖浸提過(guò)程中工藝條件的可靠性。

1.4 多糖的提取工藝及含量測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精確稱(chēng)取于105℃條件下干燥至質(zhì)量恒定的葡聚糖50.0 mg，于50 mL量瓶中，加適量水溶解后定容，搖勻備用。分別精密移取該溶液0、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL于 10 mL容量瓶中，加水定容，搖勻后各取2.0 mL于25 mL具塞刻度試管中（每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)），另取2.0 mL蒸餾水作空白對(duì)照。分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%的苯酚溶液1.0 mL，混勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，立即搖勻。放置10 min，置于沸水浴中保溫15 min，取出后迅速冷卻至室溫，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度A。以葡萄糖質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。計(jì)算得歸回方程為Y=0.160293A-0.0125，r=0.9992，Y為葡萄糖的含量（mg），A為吸光度，r為相關(guān)系數(shù)。

1.4.2 荷葉離褶傘菌絲體多糖提取工藝流程

發(fā)酵罐培養(yǎng)8 d后，用300目篩過(guò)濾，經(jīng)真空冷凍（-70℃、12 h） 干燥→粉碎→浸提→4 000 r·min-1離心10 min取上清液→Sevag法除蛋白→離心取下層澄清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮→加乙醇沉淀4℃冰箱中過(guò)夜→離心（4 000 r·min-1）10 min取沉淀→沉淀用乙醇洗滌2次→定容顯色→測(cè)吸光度→粗多糖得率。

1.4.3 多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸顯色法[8]測(cè)定多糖含量，以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)。多糖提取率（P）公式如下：

式中：C為荷葉離褶傘多糖質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；V為荷葉離褶傘多糖提取液的體積（mL）；m為荷葉離褶傘菌絲體粉末質(zhì)量（mg）。

1.5 還原力測(cè)定

參考 Oyaizu[9]的方法。分別吸取濃度為 200 μg·mL-1、400 μg·mL-1、600 μg·mL-1、800 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1的荷葉離褶傘菌絲體多糖溶液和抗壞血酸（Vc）溶液各1.0 mL置具塞試管中，分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol·L-1，pH6.6） 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液5 mL，置于50℃水浴中反應(yīng)20 min，然后加入體積分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸5 mL，搖勻，于5 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液2.5 mL加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL0.1%的三氯化鐵溶液，混合均勻，室溫下反應(yīng)10 min后在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定光密度值（以蒸餾水代替樣品的混合液作參比溶液），光密度值越大表明還原力越強(qiáng)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并進(jìn)行Duncan新復(fù)極差多重比較分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（X±SE），p<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 粉碎度對(duì)粗多糖得率的影響

粉碎的目的在于增加原料與萃取劑之間的接觸面積，理論上粉碎度越大越好，但提取過(guò)程中包括擴(kuò)散、滲透、溶解過(guò)程，實(shí)踐證明粉碎度并非越大越好。粉碎度對(duì)荷葉離褶傘菌絲體多糖得率的影響見(jiàn)表1。

表1 粉碎度對(duì)荷葉離褶傘菌絲體多糖得率的影響

從表1可以看出，隨著粉碎度的增大，粗多糖得率提高，當(dāng)原料粉碎度為100目時(shí)，粗多糖得率達(dá)到（2.75±0.1368）%，粗多糖得率最高；粉碎度進(jìn)一步增大，粗多糖得率降低。因此，確定粉碎度為100目。

2.1.2 料液比對(duì)粗多糖得率的影響

稱(chēng)取100目原料按不同料液比在90℃浸提3 h，添加3倍乙醇，4℃冰箱過(guò)夜。一般來(lái)說(shuō)，液料比越大提取效果越好。但是，從細(xì)胞中提取多糖的過(guò)程除了簡(jiǎn)單的擴(kuò)散過(guò)程之外，還有受細(xì)胞膜影響的阻滯擴(kuò)散過(guò)程，而阻滯擴(kuò)散速度取決于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。當(dāng)溶劑用量增加到一定時(shí)再增加也不會(huì)提高溶劑中多糖含量。料液比對(duì)荷葉離褶傘菌絲體多糖得率的影響見(jiàn)表2。

表2 料液比對(duì)荷葉離褶傘菌絲體多糖得率的影響

從表2可以看出，料液比達(dá)到1∶80時(shí)，粗多糖得率最高，考慮到液料比太高會(huì)加重后續(xù)的濃縮以及純化工的能耗。因此，確定料液比為1∶80。

2.1.3 浸提溫度對(duì)粗多糖得率的影響

稱(chēng)取100目原料按料水比1∶80在不同溫度下浸提3h，添加3倍乙醇，4℃冰箱過(guò)夜醇沉。浸提溫度對(duì)粗多糖得率的影響見(jiàn)表3。

從表3可以看出，隨著浸提溫度的升高，粗多糖得率顯著提高，但超過(guò)一定溫度后，高溫長(zhǎng)時(shí)間的浸提會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，同時(shí)考慮到高溫會(huì)使雜質(zhì)溶出量增加，為后續(xù)處理帶來(lái)不便，并影響其生物活性。因此，溫度不宜過(guò)高，確定浸提溫度為90℃。

2.1.4 浸提時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

表3 浸提溫度對(duì)粗多糖得率的影響

稱(chēng)取100目原料按料水比1∶80在90℃下浸提不同時(shí)間，添加3倍乙醇，過(guò)夜醇沉。浸提時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響見(jiàn)表4。

表4 浸提時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

從表4可以看出，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，粗多糖得率顯著提高；2.5 h后，粗多糖得率有下降趨勢(shì)，可能是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致多糖遭受破壞。因此，確定浸提時(shí)間為2 h。

2.1.5 乙醇沉淀倍數(shù)對(duì)粗多糖得率的影響

乙醇沉淀多糖主要取決于多糖的濃度和多糖的類(lèi)別，化學(xué)組成和分子量。選擇不同乙醇沉淀倍數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 乙醇沉淀倍數(shù)對(duì)粗多糖得率的影響

從表5可以看出，隨著乙醇沉淀倍數(shù)的增加，多糖的含量也在增加，隨著乙醇添加倍數(shù)的繼續(xù)增大，粗多糖得率仍有提高，但與乙醇添加倍數(shù)3相比，差異并不顯著?？紤]到能耗問(wèn)題，確定3倍乙醇沉淀多糖。

2.1.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗多糖提取率的影響

醇沉濃度是影響多糖提取的最主要因素。一般情況下，多糖的分子量越大，被沉淀下來(lái)所需的乙醇濃度越?。灰掖紳舛仍酱?，沉淀下來(lái)的分子量越小，多糖得率越高。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗多糖得率的影響見(jiàn)表6。

從表6可得知，多糖提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增加后下降，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%時(shí)多糖提取率達(dá)到最大值（4.55±0.0356）%。乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)95%后，多糖提取率變化不明顯，且增加提取成本。因此，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%。

2.2 荷葉離褶傘菌絲體粗多糖提取工藝的優(yōu)化

選擇料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)對(duì)多糖提取影響較大的因素，按L9(34)設(shè)計(jì)四因素、三水平的正交試驗(yàn)，見(jiàn)表7、表8。

表6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗多糖得率的影響

表7 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平表

表8 荷葉離褶傘菌絲體多糖提取正交實(shí)驗(yàn)方案

由極差分析得出影響效果為B＞A＞C＞D，進(jìn)一步根據(jù)各水平的均值比較，確定熱水提取荷葉離褶傘菌絲體多糖的最佳工藝參數(shù)為A2B1C2D3,即浸提溫度90℃、浸提時(shí)間2 h、料液比1∶80、乙醇體積分是95%。

2.3 粗多糖浸提最佳工藝條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳工藝條件下進(jìn)行提取多糖的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，稱(chēng)取原料按目數(shù)100，料水比1∶80，90℃浸提2 h，重復(fù)2次，得率分別為4.12%、4.34%，則平均得率為4.23%，高于正交試驗(yàn)的各組，說(shuō)明試驗(yàn)中得出的工藝條件是可靠的。

2.4 多糖還原力測(cè)定結(jié)果

抗氧化劑能夠通過(guò)自身的還原作用給出電子使自由基變成穩(wěn)定的分子，從而失去活性；還原力越大，抗氧化能力就越強(qiáng)。因此可根據(jù)Fe3＋還原為Fe2＋的多少來(lái)間接評(píng)價(jià)各種提取物的抗氧化能力。在試驗(yàn)濃度范圍，還原力測(cè)試液的吸光值隨著濃度的增加而增大（圖1），低濃度時(shí)吸光值較低，當(dāng)濃度增至1 000 μg·mL－1時(shí)，測(cè)試混合液的吸光值為0.435，說(shuō)明荷葉離褶傘菌絲體多糖具有一定的還原力，但與抗壞血酸Vc相比，還原力較弱。

圖1 荷葉離褶傘菌絲體多糖的還原能力

3 討論與結(jié)論

多糖不僅是機(jī)體主要供能物質(zhì)，同時(shí)還具有多種多樣的生物學(xué)功能，在生命活動(dòng)中參與了細(xì)胞的各種活動(dòng)。在我國(guó)的中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中，研究天然多糖無(wú)論是在藥學(xué)方面還是在藥理學(xué)方面都已取得了明顯的進(jìn)步[10，11]。許多研究表明，高等真菌子實(shí)體和菌絲體多糖具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、降血糖等活性[12－15]。以往的真菌多糖多從子實(shí)體中提取得到，由于生產(chǎn)周期長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大、受氣候影響嚴(yán)重，產(chǎn)量及質(zhì)量不穩(wěn)定，且子實(shí)體木質(zhì)化程度高，多糖提取效率較低。本研究采用熱水提取、乙醇沉淀、Sevage法除蛋白提取了荷葉離褶傘菌絲體多糖，工藝操作簡(jiǎn)單，較適用于工業(yè)生產(chǎn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)，確定了影響荷葉離褶傘菌絲體多糖提取率因素的主次關(guān)系是：浸提溫度＞浸提時(shí)間＞料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。荷葉離褶傘菌絲體多糖提取最優(yōu)工藝條件是粉碎度100目、料水比1∶80（g·mL－1）、浸提溫度90℃、浸提時(shí)間2 h、添加3倍95%乙醇醇沉。苯酚－硫酸法測(cè)定此最佳提取工藝條件下粗多糖得率可達(dá)4.23%。

生物體中不斷產(chǎn)生的羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2－·），具有很強(qiáng)的氧化能力，當(dāng)它們的存在超出機(jī)體防御系統(tǒng)所具有的清除能力時(shí)，這些自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)就會(huì)直接或間接地降低酶活性，促使多糖降解、DNA鏈斷裂，從而引起體內(nèi)代謝紊亂，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生[16]。多糖結(jié)構(gòu)中的醇羥基可以與產(chǎn)生·OH等自由基所必需的金屬離子絡(luò)合，使羥自由基的產(chǎn)生受到抑制，最終抑制活性氧的產(chǎn)生[17]。本試驗(yàn)是通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)荷葉離褶傘粗多糖的抗氧化功效進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，荷葉離褶傘多糖具有一定的體外抗氧化能力，且在供試濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加而增強(qiáng)，但與抗壞血酸Vc相比，還原力較弱。而在生物體內(nèi)多糖的抗氧化作用途徑更為復(fù)雜。作為外源性抗氧化劑，多糖作用的機(jī)理除直接參與猝滅自由基的途徑外，還可能通過(guò)參與調(diào)動(dòng)或激活機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化劑，從而避免或減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷。多糖在實(shí)驗(yàn)體系中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，這可能是多糖抗衰老、抗炎癥、降血脂、抗腫瘤等功效的藥理基礎(chǔ)[18]。目前，國(guó)內(nèi)外已將抗氧化檢測(cè)用于抗衰老等保健食品的評(píng)價(jià)，對(duì)保健食品開(kāi)發(fā)具有積極作用[19]。因此，可開(kāi)發(fā)具有抗氧化、抗衰老作用的荷葉離褶傘多糖功能性保健食品，有關(guān)荷葉離褶傘多糖體內(nèi)抗氧化作用及與其多糖的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)及在生物體內(nèi)的生物學(xué)活性差異有待進(jìn)一步研究。

[1]黃年來(lái)．中國(guó)大型真菌原色圖鑒[M]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[2]卯曉嵐．中國(guó)經(jīng)濟(jì)真菌[M]．北京：科學(xué)出版社，1998.

[3]李林玉，李榮春．荷葉離褶傘菌絲營(yíng)養(yǎng)條件的初步研究[J]．中國(guó)食用菌，2004，24(3)：30-32.

[4]魏生龍，王治江，于海萍，等．荷葉離褶傘分離馴化研究[J]．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14(5)：128-131.

[5]魏生龍，王治江，于海萍，等．荷葉離褶傘生物學(xué)特性研究[J]．菌物學(xué)報(bào)，2005，25(1)：101-108.

[6]魏生龍．荷葉離褶傘食用菌菌種：中國(guó)，ZL200510096405.0[P].2008-07-02.

[7]陳欣，龔蘭，劉冠卉．食用真菌多糖提取條件的優(yōu)化及其還原力的比較[J]．食品科學(xué)，2010，31(14)：140-144.

[8］張維杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)（2版）[M]．杭州：浙江大學(xué)出版社，2006.

[9]Oyaizu M.Antioxidative activity of browning products of glucosaminefractionated by organic solvent and thin layer chromatography[J].Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi,1986(35):771-775.

[10]王紅英．中藥多糖研究進(jìn)展[J]．實(shí)用醫(yī)技雜志，2006，13(6)：10-21.

[11]鄧小云，丁登峰，戴美紅，等．植物多糖藥理作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，12(9)：45-53.

[12]Chung CS,Lu MK,Cheng JJ,et al.An tiangiogenic activities of polysaccharides isolated from medicina fungi[J].Fems Microbiol Lett,2005(249):247-254.

[13]Li SP,Zh ang GH,Zeng Q,et al.Hypoglycemic activity of polysaccharide with antioxidation isolated from cultured Cordyceps mycelia[J].Phytomedicine,2006(13):428-433.

[14]Zhang M,Cui SW,Cheung PCK,et al.Antitum or polysaccharides from mushrooms:a review on their isolation process,structural characteristics and antitum or activity[J].Trends Food Sci.Tech.,2007(18):4-19.

[15]Wasser SP.Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002(60)：258-274.

[16]盛偉，方曉陽(yáng)．杏鮑菇菌絲體胞內(nèi)與胞外多糖體外抗氧化活性研究[J]．中國(guó)林副特產(chǎn)，2009(1)：7-10.

[17]Volpi N,Tarugi P.Influence of chondroitin sulfate charge density,sulfate group position,and molecularmass on Cu2+-mediated oxidation of human low-density lipoproteins:Effect of normal human plasma derived chondroitin sulfate[J].The Journal of Biochemistry,1999(125):297-304.

[18]顧有方，李衛(wèi)民，李升和，等．大棗多糖對(duì)小鼠四氯化碳誘發(fā)肝損傷防護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2006，13(2)：105-107.

[19]鄭晶泉．抗氧化劑抗氧化實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2000，27(1)：37-40.