舒佳賓，文 李，官春云

(1國(guó)家油料作物改良中心湖南分中心，長(zhǎng)沙410128;2長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程系，長(zhǎng)沙410114;3衢州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，浙江衢州324000)

油菜是世界上除大豆之外的第二大油料作物，占全世界植物油供應(yīng)的13%［1］。中國(guó)是油菜生產(chǎn)大國(guó)，種植面積和產(chǎn)量居世界之首，其產(chǎn)量和品質(zhì)影響著中國(guó)食用油的安全。油菜菌核病常年發(fā)病率在10% ～30%［2］，每年 可 以 使油 菜的 產(chǎn)量 減 少15% ～30%，種子含油量也相應(yīng)降低1% ～5%［3］。有研究表明，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速和高通量特點(diǎn)可為植物抗病研究提供新的方向［4，5］。

蛋白質(zhì)雙向電泳(Two－dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2 － DE)技術(shù)［6，7］是利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的不同來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。它通過(guò)第一向的等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)使蛋白質(zhì)按照等電點(diǎn)進(jìn)行初次分離，然后通過(guò)第二向的聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE)使蛋白質(zhì)再按照分子量的大小進(jìn)行第2次分離，進(jìn)而得到蛋白質(zhì)的二維分離圖譜，圖譜中的每個(gè)點(diǎn)代表樣品中一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)，而且可以同時(shí)呈現(xiàn)出蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量和在樣品中相對(duì)含量等屬性。近年來(lái)，該技術(shù)已經(jīng)被成功的運(yùn)用到擬南芥［8］、水稻［9，10］、小麥［11］、大豆［12］、煙草［13］、番茄［14］等植物的蛋白組學(xué)研究，而在油菜蛋白質(zhì)組學(xué)研究中主要涉及油菜葉片［15］、花［16，17］、種子［18］、根系［19］等材料。筆者比較了甘藍(lán)型油菜葉片蛋白質(zhì)的提取方法，探討了蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)優(yōu)化方案，為運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究甘藍(lán)型油菜抗菌核病提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為抗菌核病甘藍(lán)型油菜近等基因系98c40和湘油15×98c40(由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所培育提供)，盛花期時(shí)利用牙簽接種，取葉片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

尿素、SDS、硫脲、Tris－ HCl、Gly、二硫蘇糖醇(DTT)、3－［3－(膽酰胺基丙基)二甲氨基］丙磺酸(CHAPS)、溴酚藍(lán)、PVP購(gòu)自Sigma公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)、丙烯酰胺、N，N’－甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、TEMED、IPG Buffer、碘乙酰胺、兩性電解質(zhì)、礦物油、低熔點(diǎn)瓊脂封膠液、30%甘油溶液、考馬斯亮藍(lán)G250購(gòu)自Bio－Rad公司;牛血清白蛋白(BSA)、蛋白質(zhì)電泳 Loading buffer等購(gòu)自天根生物;其余生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。Protein IEF等電聚焦儀、灌膠模具、電泳儀、GS－800掃描儀等均購(gòu)自Bio－Rad公司;恒溫循環(huán)水浴鍋購(gòu)自AmerSham，凍干機(jī)為EYELA FDU－2100。

1.2 方法

1.2.1 葉片蛋白質(zhì)的提取

用TCA/丙酮法提取葉片總蛋白，參照Damerval等［20］的方法，但略做改進(jìn)。即取1 g葉片，放入預(yù)冷的研缽中，迅速加入液氮，并加入約10%PVP和適量石英砂充分研磨成粉末，迅速懸浮于約10倍體積－20℃預(yù)冷的含10%三氯乙酸(TCA)和0.07%二硫蘇糖醇(DTT)的丙酮溶液中，充分混勻后放在－20℃冰箱中靜置過(guò)夜，期間顛倒混勻數(shù)次。4℃12 000 rmp離心30 min，棄上清;在沉淀中加入約10倍體積－20℃預(yù)冷的含0.07%二硫蘇糖醇(DTT)的丙酮溶液，混勻后放在－20℃冰箱中靜置1 h后，4℃12 000 rmp離心30 min，棄上清，重復(fù)4～5次該步驟。將最后獲得的沉淀放入凍干機(jī)中進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥后的粉末－80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谡麄€(gè)提取過(guò)程中盡量保持低溫，并加入1 mmol/L的PMSF，以防蛋白質(zhì)水解。

用Tris－Cl法提取葉片總蛋白。取1 g葉片，迅速放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮、石英砂和PVP充分研磨。迅速將其轉(zhuǎn)移到離心管中，加入冰上預(yù)冷的蛋白提取混合液Ⅰ(65 mmol/L Tris－HCl，調(diào)pH值至6.8，0.5%SDS，10%甘油，5%β－巰基乙醇)，漩渦震蕩1 min，放入4℃冰箱中靜置30 min，期間每10 min震蕩混勻1次，4℃12 000 rmp離心30 min，取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中;加入10倍體積預(yù)冷的蛋白提取混合液Ⅱ(10%TCA，0.07%DTT的丙酮混合液)，混勻后放入－20℃冰箱中靜置1 h，4℃12 000 rmp離心30 min，棄上清;再加入預(yù)冷的含0.07%DTT的丙酮溶液震蕩混勻，放入－20℃冰箱中靜置1 h，4℃12 000 rmp離心30 min，棄上清，該步驟重復(fù)3～5次。將最后獲得的沉淀放入凍干機(jī)中進(jìn)行真空冷凍干燥，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白質(zhì)的定量

在1 mg蛋白質(zhì)樣品中加入25 μL水化液(8 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4%CHAPS，0.001% 溴酚藍(lán)，臨用前加入1.3 mmol/LDTT，0.5%IPG Buffer，1 mmol/L PMSF)，在30℃下震蕩溶解30 mim，室溫下12 000 rmp離心30 min。蛋白質(zhì)的定量按照Bradford法，以牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

1.2.3 蛋白質(zhì)的雙向電泳

(1)第一向等電聚焦(IEF)。采用17 cm Bio－Rad固相預(yù)制膠條，并按照Bio－Rad雙向電泳操作手冊(cè)進(jìn)行。根據(jù)1.2.2介紹方法定量測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，計(jì)算出所要吸取的樣品量，本實(shí)驗(yàn)的上樣量分別采用1 mg和800 μg進(jìn)行比較，上樣體積為300 μL。將樣品加入到聚焦槽中，然后把膠條表面的保護(hù)膜去掉，膠面朝下，輕輕放入膠槽中，該過(guò)程中應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生。覆蓋一層礦物油后，放入等電聚焦儀的電極板上，先50 V水化14 h，再按照表1進(jìn)行等點(diǎn)聚焦。

表1 等電聚焦程序

(2)膠條的平衡。將膠條放入平衡液Ⅰ(6 mol/L尿素，2%SDS，0.375 mol/L Tris － HCl，20%甘油，130 mmol/L DTT)中，置于搖床上輕搖15 min;然后放入平衡液Ⅱ(6 mol/L尿素，2%SDS，0.375 mol/L Tris－HCl，20%甘油，135 mmol/L 碘乙酰胺)，置于搖床上輕搖15 min。

(3)第二向SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)。將平衡后的膠條用SDS－PAGE電極緩沖液沖洗一下，并側(cè)置于濾紙上約1 min，然后轉(zhuǎn)移至分離膠上，并在負(fù)極端的外側(cè)加上蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，排凈氣泡后，用低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液封閉，待封膠液凝固后開(kāi)始進(jìn)行第二向垂直電泳。開(kāi)啟恒溫循環(huán)泵使其保持在15℃，30 mA/兩塊膠，恒流電泳30 min后，改用60 mA/兩塊膠，恒流電泳大約7.5 h，當(dāng)溴酚藍(lán)距膠底約1 cm處停止電泳。

(4)染色。運(yùn)用改良的考馬斯亮藍(lán)染色法。染色前用12%的TCA溶液固定1 h，取200 mL染色液(12% 考馬斯亮藍(lán) G250，10%(NH4)2SO4，10%H3PO4)加入50 mL甲醇混合后，放到搖床上輕搖12～24 h進(jìn)行染色，脫色采用0.1 mol/L Tris－H3PO4(pH 6.5)浸泡1 min，再用25%甲醇漂洗至背景為無(wú)色。再?gòu)?fù)染1次(搖床上2～5 h即可)，再脫色。

1.2.4 凝膠掃描和圖像分析

待SDS－PAGE凝膠脫色完全后，用Bio－Rad GS－800掃描儀和Quantity One軟件進(jìn)行圖像掃描，掃描分辨率為 300 dpi，掃描得到的圖像用PDQuest 8.0.1進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)提取方法比較

本實(shí)驗(yàn)分別采用TCA/丙酮法和Tris－Cl法進(jìn)行葉片蛋白質(zhì)的提取，用pH為3～10的17 cm預(yù)制膠條跑出的雙向電泳圖如圖1所示。從圖中虛線(xiàn)框中可以看出，用TCA/丙酮法提取的蛋白(圖1－A)與Tris－HCl法(圖1－B)相比，表現(xiàn)出更好的聚焦效果，基本沒(méi)有條紋狀蛋白，且背景也相對(duì)清晰。從實(shí)線(xiàn)框中對(duì)比可以看出，用TCA/丙酮法能夠分離出更多的蛋白點(diǎn)，蛋白點(diǎn)清晰，且高豐度的蛋白點(diǎn)有所減少。由于油菜葉片中含有大量的鹽離子、多糖多酚、色素等植物次生代謝產(chǎn)物，對(duì)蛋白質(zhì)雙向電泳產(chǎn)生一定的干擾，重復(fù)性差。所以本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)TCA/丙酮蛋白質(zhì)提取方法的基礎(chǔ)之上，在研磨中加入石英砂和PVP，使研磨更充分，并通過(guò)PVP去除多糖多酚和色素，使雙向電泳的重復(fù)性提高。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，第1次TCA/丙酮沉淀時(shí)放在－20℃過(guò)夜，期間需要隔1～2 h震蕩混勻1次，后面重復(fù)沉淀1 h，沉淀5次左右提取的蛋白質(zhì)純度較好。因此，用改良后的TCA/丙酮法更適合甘藍(lán)型油菜葉片蛋白的提取。

圖1 不同提取方法下甘藍(lán)型油菜葉片蛋白質(zhì)雙向電泳圖

2.2 上樣量的確定及蛋白酶抑制劑添加

從圖2可以看出，蛋白質(zhì)成塊的聚集在一起，是加樣量過(guò)多的表現(xiàn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上樣量為每17 cm膠條800 μg較適宜。在提取過(guò)程中未加入蛋白酶抑制劑PMSF，容易使蛋白質(zhì)大量降解，呈模糊的涂抹狀，不利于雙向電泳的進(jìn)行。

圖2 不同上樣量及蛋白酶抑制劑雙向電泳圖

2.3 預(yù)制膠條和分離膠濃度的選擇

從圖3可以看出，pH3～10的膠條不能把蛋白質(zhì)很好的分離，大部分蛋白質(zhì)主要集中在pH4～7之間(圖3－A)，改用pH4～7的膠條重新進(jìn)行雙向電泳后發(fā)現(xiàn)，原來(lái)集中在pH3～10中間的蛋白點(diǎn)已經(jīng)被很好的分離開(kāi)(圖3－B)，說(shuō)明用pH4～7的膠條比較合適。

第二向SDS－PAGE中，分離膠濃度影響蛋白質(zhì)的分離效果。從圖4－A中虛線(xiàn)框中可以看出，10%的聚丙烯酰胺凝膠不能很好地使不同分子量的蛋白質(zhì)得到分離，蛋白質(zhì)呈縱向條狀或聚集成一片;而改用12%的聚丙烯酰胺凝膠后，分離效果明顯提高。從圖4－B和圖3－B中可以看出，運(yùn)用12%的分離膠結(jié)合pH 4～7的膠條，能使蛋白質(zhì)很好的分離，能夠分離出2 000多個(gè)蛋白點(diǎn)。

圖3 不同pH膠條雙向電泳圖

圖4 不同分離膠濃度雙向電泳圖

2.4 復(fù)染對(duì)蛋白點(diǎn)呈現(xiàn)的影響

從圖5可以看出，圖5－A中虛線(xiàn)框部位只隱約看見(jiàn)幾個(gè)點(diǎn)，經(jīng)過(guò)2～5 h復(fù)染脫色后，在圖5－B中很多點(diǎn)變得清晰，而且呈現(xiàn)出圖5－A中很多原來(lái)沒(méi)有的點(diǎn)，其他部位的點(diǎn)也相應(yīng)增加或增強(qiáng)。該現(xiàn)象在后續(xù)的試驗(yàn)中都得到了很好的驗(yàn)證，都使蛋白質(zhì)點(diǎn)增多增強(qiáng)，而且背景基本不加深。這可能是在第1次染色中趨于飽和，但通過(guò)脫色過(guò)程中甲醇、水等物質(zhì)的作用，膠的性質(zhì)發(fā)生變化，使其更易和染料結(jié)合，從而使低豐度的蛋白質(zhì)更好的呈現(xiàn)。

圖5 不同染色次數(shù)的蛋白點(diǎn)呈現(xiàn)效果圖

3 討論與結(jié)論

甘藍(lán)型油菜葉片中存在大量的酚類(lèi)、多糖類(lèi)、醌類(lèi)、脂類(lèi)和色素等植物次代謝產(chǎn)物，多糖中存在高電荷密度能夠以離子鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，多酚能與蛋白質(zhì)能以氫鍵結(jié)合，干擾蛋白質(zhì)等電聚焦，所以在提取蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)盡量去除雜質(zhì)，且減少蛋白質(zhì)的降解［21］。周蘊(yùn)薇等［22］在研磨時(shí)加入 PVP能有效去除葉片中多糖多酚等物質(zhì)。不同的蛋白質(zhì)提取方法能夠?qū)е伦詈蟮鞍踪|(zhì)點(diǎn)的差異［23～26］，Saravanan 等［25］報(bào)道在西紅柿中使用三種不同的蛋白質(zhì)提取方法獲得2－DE蛋白質(zhì)點(diǎn)具有很大的區(qū)別。這可能由于蛋白質(zhì)提取過(guò)程中糖基化不同而造成的。而對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)材料因所含糖類(lèi)、脂類(lèi)、色素等物質(zhì)的不同，所選用的最適提取方法也有所不同［27］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前人研究，在葉片研磨時(shí)加入約10%PVP和適量的石英砂，運(yùn)用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì)，比用Tris－HCl法獲得的雙向電泳圖像更清晰，分離更充分，且穩(wěn)定性好，適合甘藍(lán)型油菜葉片雙向電泳蛋白質(zhì)的提取。

第二向分離膠合適濃度的選擇是蛋白質(zhì)充分分離的基礎(chǔ)。分離膠的濃度與凝膠孔徑成反比，蛋白質(zhì)或多肽在膠中的遷移速率與其分子量成反比［28］當(dāng)分離膠濃度過(guò)小時(shí)，容易使小分子蛋白質(zhì)丟失［29］。本研究通過(guò)對(duì)比10%和12%分離膠濃度對(duì)蛋白質(zhì)的分離效果，確定12%的分離膠濃度能使甘藍(lán)型油菜葉片蛋白質(zhì)得到很好的分離。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用改進(jìn)的TCA/丙酮法比Tris－HCl法更適合甘藍(lán)型油菜葉片蛋白質(zhì)的提取;用pH為4～7的固相膠條和12%的SDS－PAGE凝膠能夠使蛋白質(zhì)得到充分分離;上樣量為800 μL時(shí)得到的圖片比上樣量為1 mg時(shí)清晰，分離充分，不產(chǎn)生聚集現(xiàn)象;采用膠塊2次復(fù)染方法，可加強(qiáng)蛋白質(zhì)點(diǎn)的染色效果，使低豐度蛋白得以呈現(xiàn)，給后續(xù)分析帶來(lái)便利的同時(shí)，增加了差異蛋白點(diǎn)的數(shù)目，提高了實(shí)驗(yàn)的解析度。總之，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究，建立和優(yōu)化了適合甘藍(lán)型油菜葉片雙向電泳體系，提出膠塊復(fù)染的作用效果，能夠分離出2 000個(gè)以上的蛋白點(diǎn)，且實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定重復(fù)性強(qiáng)，可為后續(xù)油菜抗菌核病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考。

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