張寶俊，張家榕，韓巨才，劉慧平

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷030801）

植物內(nèi)生芽孢桿菌能分泌多種抗菌物質(zhì)，在植物病害生物防治中具有良好的應(yīng)用前景［1］。近年來國內(nèi)外學者先后從植物內(nèi)生芽孢桿菌中分離到脂肽、細菌素、抗菌蛋白等多種抗菌物質(zhì)，并對其抑菌活性、抑菌機理及分子結(jié)構(gòu)等進行了研究［2～4］，為該類微生物在植物病害生物防治中的應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)，但真正應(yīng)用到生產(chǎn)中的數(shù)量有限，其主要原因一是拮抗菌抗菌物質(zhì)的代謝量較少、抑菌活性低，缺乏應(yīng)用開發(fā)的基礎(chǔ)；二是抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性差，從而限制了其應(yīng)用。因此篩選高活性拮抗菌株，并對其分泌的抗菌物質(zhì)進行研究將會促進植物內(nèi)生菌的開發(fā)及應(yīng)用。本試驗前期從梨樹內(nèi)分離到1株拮抗芽孢桿菌LP－3，該菌株對多種植物病原菌具有抑菌作用，為分析其抗菌物質(zhì)的類型及抑菌活性，本研究采用不同有機溶劑對該菌株分泌的抗菌物質(zhì)進行提取，并對抗菌粗提物的抑菌活性進行分析，研究結(jié)果為進一步開發(fā)及利用該抗菌物質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及病原菌

LP－3菌株分離于山西農(nóng)業(yè)大學果園梨樹木質(zhì)部。梨黑斑病菌Alternaria alternata、黃瓜黑斑病菌Alternaria cucumerina、玉米黑粉病菌Ustilago maydis、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、辣椒疫病菌Phytophthora capsici、番茄早疫病菌Alternaria solani、黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum、辣椒枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum 和小麥赤霉病菌Fusarium graminearum 等9種病原菌為山西農(nóng)業(yè)大學化保實驗室保存菌種。

1.1.2 供試藥劑

97.8%腐霉利、50% 異菌脲（如東縣光榮合成化工廠）。

1.2 最佳萃取溶劑的篩選

將LP－3種子發(fā)酵液按1%的比例接種于BPY培養(yǎng)液中，30℃、160r·min－1振蕩培養(yǎng)72h，10 000r·min－1離心10min去除菌體獲得發(fā)酵液，分別用等體積的氯仿、乙酸乙酯、苯、石油醚萃取，甲醇萃取采用“酸沉醇提”的方法［5］。各萃取3次，合并有機相，在40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用甲醇溶解并定容至10mL，0.45μm微孔濾膜過濾后以梨黑斑病菌為指示菌，生長速率法測定各有機相及水相的抑菌活性。

1.3 粗提物與殺菌劑對病菌菌絲毒力比較

粗提物設(shè) 1.25mg·L－1、6.25mg·L－1、12.5mg·L－1、25mg·L－1和50mg·L－15個濃度梯度；腐霉利設(shè)0.625mg·L－1、1.25mg·L－1、6.25mg·L－1、12.5mg·L－1和25mg·L－15個濃度梯度；異菌脲設(shè)25mg·L－1、50mg·L－1100mg·L－1、200mg·L－1和500mg·L－15個濃度梯度，將各濃度藥液分別與PDA培養(yǎng)基按1∶9的比例混合制備含藥平板，接入梨黑斑病菌菌塊，25℃恒溫培養(yǎng)5d后分析各藥劑對梨黑斑病菌菌絲生長的抑制作用。

1.4 粗提物與殺菌劑對病菌孢子毒力比較

采用懸滴法，制備濃度為3.0～5.0×105個·mL－1的梨黑斑病菌孢子懸浮液，分別與不同濃度的腐霉利、異菌脲和LP－3粗提物藥液混合，使其終濃度為0.625mg·L－1、1.25mg·L－1、2.5mg·L－1、5mg·L－1、10mg·L－1，28℃保濕培養(yǎng)12h后，觀察孢子的萌發(fā)情況，測定3種藥劑對梨黑斑病菌孢子萌發(fā)率的影響。以芽管長度超過孢子直徑一半計為萌發(fā)，每處理3次重復(fù)。

1.5 LP－3粗提物抗菌譜測定

依據(jù)預(yù)實驗中不同病原菌對粗提物的敏感性的不同設(shè)定不同濃度梯度，并與分別與PDA培養(yǎng)基按1∶9的比例混合制備含藥平板，接入直徑為5mm的病菌菌塊，25℃恒溫培養(yǎng)5d，測定各處理的菌落直徑，用DPS6.0軟件分析粗提物對9種植物病原真菌的毒力，以無菌水為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳萃取溶劑篩選結(jié)果

試驗結(jié)果如圖1所示，5種有機溶劑萃取物對梨黑斑病菌的抑制率差異明顯，其中甲醇的萃取效果最佳，其有機相對梨黑斑病菌的抑制率為68.4%，水相抑菌率為35.9%，表明大多抗菌物質(zhì)溶于甲醇中，苯的萃取效果較差，其有機相對梨黑斑病菌的抑制率僅為11.3%，而水相抑菌率高達60.4%，5種有機溶劑萃取物的抑菌率依次為甲醇＞三氯甲烷＞乙酸乙酯＞石油醚＞苯。為達到對抗菌物質(zhì)分離純化的目的，選擇用甲醇為萃取溶劑對LP－3菌株分泌的抗菌物質(zhì)進行大量萃取。

圖1 5種有機相和水相抗菌活性Fig.1 Antagonistic activities of extracts from five different solvent extractions

2.2 粗提物與殺菌劑對菌絲毒力測定結(jié)果

由表1可見，LP－3抗菌粗提物、腐霉利和異菌脲對梨黑斑病菌菌絲生長的抑制中濃度分別為1.18mg·L－1、0.34mg·L－1和14.41mg·L－1，該粗提物對梨黑斑病菌菌絲生長具有較強的抑制作用，其EC50小于生產(chǎn)上常用藥劑異菌脲對梨黑斑病菌菌絲的EC50，雖然稍高于腐霉利對病菌菌絲的EC50，但該抗菌物質(zhì)為微生物的分泌代謝產(chǎn)物，與環(huán)境有很好的相容性，因此具有一定的開發(fā)潛力。

2.3 粗提物與殺菌劑對孢子毒力測定結(jié)果

由表2可見，LP－3抗菌粗提物、腐霉利和異菌脲對梨黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制中濃度分別為3.61mg·L－1、3.56mg·L－1、5.69mg·L－1，LP－3抗菌粗提物對孢子萌發(fā)的抑制效果介于腐霉利和異菌脲之間，表現(xiàn)出良好的抑菌活性。

表1 LP－3粗提物與殺菌劑對梨黑斑病菌菌絲的毒力Table 1 The toxicity of LP－3extractions and fungicides against hyphal growth of A.alternata

2.4 LP－3粗提物抗菌譜測定結(jié)果

經(jīng)測定該抗菌粗提物對9種植物病原真菌均有一定的抑制活性（表3），其EC50在1.18～67.93 mg·L－1之間，其中對梨黑斑病菌的抑制作用最強，抑制菌絲生長的 EC50為1.18mg·L－1，對番茄早疫病菌、小麥赤霉病菌和黃瓜黑斑病菌菌絲生長的EC50分別為5.53mg·L－1、7.08mg·L－1和7.32mg·L－1，對番茄灰霉病菌和辣椒枯萎病菌的抑制作用稍差，EC50分別為52.57mg·L－1和67.93mg·L－1。研究結(jié)果表明，該抗菌物質(zhì)的抗菌活性較高，抗菌譜較廣。

表3 LP－3粗提物對9種病原菌的毒力Table 3 The toxicity of LP－3extractions against nine pathogenic fungi

3 結(jié)論與討論

本研究從內(nèi)生芽孢桿菌LP－3中分離的抗菌物質(zhì)不但可以抑制梨黑斑病菌菌絲的生長，而且對梨黑斑病菌孢子的萌發(fā)也有一定的抑制活性，對梨黑斑病菌的抑菌活性甚至優(yōu)于其常用防治藥劑異菌脲對病菌的毒力。該抗菌物質(zhì)抗菌譜較廣，對9種不同植物病原真菌均有一定的抑制作用。

芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要集中在兩個方面：一是分離抗菌物質(zhì)，將其開發(fā)為相關(guān)制劑應(yīng)用于生產(chǎn)［6］；二是篩選適宜的拮抗菌株，直接在大田施用。美國迄今已有多株枯草芽孢桿菌生防菌株用于田間植物病害的防治，我國現(xiàn)已成功開發(fā)并投入生產(chǎn)的商品制劑包括亞寶、麥豐寧、百抗、紋曲寧等［7］，但高效、穩(wěn)定生防菌株的篩選仍是限制生防制劑開發(fā)的一個關(guān)鍵因素，近年來國內(nèi)外學者從植物內(nèi)生菌中篩選出一些具防病促生功能，且穩(wěn)定性好的生防菌株，Nejad等［8］分離的內(nèi)生細菌不但能促進油菜、番茄幼苗的生長，而且對番茄枯萎病菌、棉花黃萎病等病原菌有拮抗作用。黎起秦等［9］從番茄莖標本分離到1株芽孢桿菌，經(jīng)室內(nèi)和田間防治初步測定，該菌株對番茄青枯病有較好的防治效果。喬勇升［10］從茄子植株中分離獲得1株內(nèi)生枯草芽孢桿菌對茄子黃萎病菌具有較強拮抗活性，溫室盆缽試驗證明對黃萎病防治效果可達80%以上。本研究分離的梨內(nèi)生細菌LP－3不但對梨黑斑病菌具有良好的抑制效果，而且對所測其它植物病原菌也具有一定的抑制活性，為該菌株及其次生代謝產(chǎn)物的進一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。關(guān)于該菌株的田間防效及其抗菌物質(zhì)的類型、抑菌機理等尚需進一步的分析。

［1］黃麗麗，喬宏萍，康振生.植物內(nèi)生細菌及其在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用研究［J］.臨沂師范學院學報，2006，28（6）：23－28.

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