張 靜，呂琳琳，孫 靜，陳家芳，李 紓，2

(山東濟南250012:1.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院;2.山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室)

降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種具有強大擴張血管作用的生物活性多肽［1］，廣泛分布于周圍、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)。近年來研究顯示:CGRP在口腔組織中的分布具有不可忽視的意義，其在正常牙髓中的陽性表達，提示這類神經(jīng)肽具有神經(jīng)遞質(zhì)和放大刺激傳入信號的作用，從而導(dǎo)致疼痛和過敏癥狀［2］，同時CGRP還可調(diào)節(jié)牙髓中的血管生成以修復(fù)牙髓組織。此外，CGRP在口腔種植和正畸治療的牙槽骨愈合過程中也扮演著重要角色，并且受到了越來越多的關(guān)注。但是關(guān)于CGRP作為一種神經(jīng)性因子在牙齒硬組織發(fā)育過程中的作用研究和報道較少。本研究通過觀察CGRP在大鼠切牙成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞中的組織學(xué)定位和表達，為進一步研究CGRP在牙齒硬組織發(fā)育調(diào)控過程中的意義提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

6周齡雄性Wistar大鼠(山東大學(xué)動物中心提供);CGRP一抗(abcam，美國);山羊超敏二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、胰蛋白消化液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);LEICA RM2135切片機(德國);OLYMPUS BX71顯微鏡和照相系統(tǒng)(日本)。

1.2 取材和標(biāo)本處理

取6周齡雄性 Wistar大鼠，水合氯醛注射［0.4 mL/100 g(體質(zhì)量)］麻醉后用40 g/L多聚甲醛心臟內(nèi)灌注處死并內(nèi)固定，取雙側(cè)下頜骨置40 g/L的多聚甲醛中再固定12 h，流水沖洗1 h后置100 g/L的EDTA液中脫鈣60 d，經(jīng)針刺無阻力后終止脫鈣。取含切牙的組織塊，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，頰舌向連續(xù)切片(片厚5 μm)，展片后用多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片撈片，烤片3 h后置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HE 染色觀察

選取上述切片脫蠟至水，蘇木素染色10 min，流水沖洗5 min，40 g/L鹽酸乙醇分色1 s，流水返藍10 min，伊紅染色3 min，流水沖洗至背景干凈，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并進行圖像采集。

1.4 免疫組織化學(xué)染色觀察

利用HE染色確定組織結(jié)構(gòu)后，選取相鄰的切片參照山羊超敏二步法免疫組化檢測試劑盒說明進行CGRP的免疫組織化學(xué)染色。切片脫蠟至水，0.1 mol/L PBS沖洗3 min×3次;30 mL/L過氧化氫室溫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3 min×3次;滴加抗原復(fù)合消化液，37℃孵育20 min，PBS沖洗3 min×3次;滴加 CGRP一抗(1∶00)稀釋液，4℃過夜，復(fù)溫 5 min，PBS沖洗3 min×3次;滴加聚合物輔助劑，室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次;滴加DAB顯色液，顯色后立即用雙蒸水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片(陰性對照以PBS代替一抗重復(fù)以上步驟)。顯微鏡下觀察、照相，并按以下采集標(biāo)準(zhǔn)進行結(jié)果分析:①細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無淡黃色和棕黃色顆粒，蘇木素復(fù)染后細(xì)胞核呈藍色，細(xì)胞質(zhì)空白者界定為CGRP陰性表達;②細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有淡黃色顆?；蛘哧栃灾怀^10%，界定為弱陽性表達;③細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒或者陽性著色占組織的60%以上則界定為強陽性表達。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

成釉細(xì)胞排列呈柵欄狀，細(xì)胞核極性倒置，處于分泌期。成牙本質(zhì)細(xì)胞位于牙本質(zhì)內(nèi)側(cè)，牙周膜細(xì)胞位于成釉細(xì)胞外側(cè)，沿纖維方向規(guī)則排列，細(xì)胞呈長梭形(圖1)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

CGRP在牙周膜細(xì)胞中呈陽性表達，在胞漿中有淡黃色顆粒(圖2);在分泌期成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中呈強陽性表達，胞漿中有棕黃色顆粒。(圖2～3)周圍牙槽骨的骨細(xì)胞中呈陰性表達;PBS陰性對照組中牙周膜細(xì)胞、成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞均呈陰性，胞漿透明，胞核藍染(圖4)。

圖1 大鼠切牙組織學(xué)觀察

圖2 成釉細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞CGRP免疫組織化學(xué)染色

3 討論

CGRP是Rasenfeld等［3］首次利用基因重組技術(shù)合成的一種具有生物活性的神經(jīng)肽，并且在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)廣泛分布于周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)以及一些非神經(jīng)系統(tǒng)組織中。CGRP由37個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為3800 D，與腎上腺素、淀粉樣多肽同為降鈣素基因相關(guān)肽超家族的一員。CGRP受體分為CGRP 1和CGRP 2兩類，主要通過G－蛋白偶聯(lián)受體來實現(xiàn)生物多樣性并調(diào)節(jié)功能［4］。CGRP主要源于感覺神經(jīng)纖維，由脊髓后根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生，通過軸漿運輸?shù)缴窠?jīng)末梢并儲存在胞漿中。

研究發(fā)現(xiàn):CGRP在口腔組織中的分布也較為廣泛，在牙髓、牙周膜和牙槽骨中的成纖維細(xì)胞、血管周圍均有陽性分布，并且能夠調(diào)節(jié)牙周組織和牙髓的血流量。近年的研究顯示:CGRP在骨生長活躍部位的分布明顯多于其他部位［5］，并且能抑制破骨細(xì)胞的活性而抑制骨吸收;也可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的增殖而促進骨改建［6］。

在牙齒發(fā)育過程中，釉質(zhì)上皮細(xì)胞作為一個屏障過濾器能選擇性的為釉質(zhì)的形成提供鈣運輸［7］。Gill等研究發(fā)現(xiàn):CGRP能明顯增強豚鼠心房鈣內(nèi)向電流并提高心肌細(xì)胞中胞內(nèi)鈣［8］。Jacobsen等報道:切除大鼠牙齒的感覺神經(jīng)會影響牙本質(zhì)的生成，表明CGRP在牙本質(zhì)形成過程中可能也具有一定的作用［9］。本研究顯示:CGRP在分泌型成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中呈強陽性表達，與以上的研究結(jié)果相符，就此可以推測CGRP在釉質(zhì)和牙本質(zhì)礦化形成過程中可能具有一定的調(diào)控作用;再根據(jù)Gudermann等報道的CGRP可通過G蛋白偶聯(lián)受體影響細(xì)胞的分化、增殖和轉(zhuǎn)化［10］，因而也可推測CGRP在成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中的表達可能對牙齒硬組織發(fā)育過程中細(xì)胞的增殖分化具有一定的意義，但仍需要進一步的研究探討。

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