蘇 鈺，李 明，姜 碩，鄭東澤

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030）

亞麻（Linum usitatissimum L.）作為一種優(yōu)質(zhì)的纖維作物和油料作物，在工農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有重要的經(jīng)濟價值。近年來，分子標記技術(shù)在亞麻種質(zhì)資源遺傳多樣性、分子標記輔助育種、異基因標記、染色體連鎖圖譜構(gòu)建等研究方面得到廣泛應用[1]，且主要是RAPD、AFLP和RFLP標記。與上述標記技術(shù)相比SSR標記具有多態(tài)性高、呈共顯性遺傳、數(shù)量豐富、易于用PCR檢測和在基因組上分布均勻等優(yōu)點[2]，基于EST開發(fā)的SSR標記由于源自編碼區(qū)，可直接用于基因作圖和基因發(fā)掘，并因其信息量大、通用性好、開發(fā)簡單等優(yōu)越性成為近年來分子標記研究熱點。目前小麥[3]、水稻[4]、棉花[5]、大豆[6]等作物研究中開發(fā)出的EST-SSR標記已在遺傳圖譜構(gòu)建、通用性與比較作圖、遺傳多樣性分析、品種鑒別方面得到了廣泛應用，而已報道的亞麻EST-SSR標記數(shù)目較少[7]，遠不能滿足研究需要。本研究利用從NCBI公共數(shù)據(jù)庫下載的EST序列開發(fā)出65對EST-SSR引物，以期增加亞麻的可用EST-SSR標記數(shù)量，為EST-SSR標記技術(shù)在亞麻遺傳育種的應用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及總DNA的提取

用于EST-SSR引物多態(tài)性研究的20份亞麻材料來自東北農(nóng)業(yè)大學亞麻研究室（見表1）。所有材料播種于東北農(nóng)業(yè)大學香坊實驗實習基地，于苗期取幼嫩葉片洗凈，存放于-70℃冰箱中，10 d后液氮研磨，采用改進后的CTAB法提取亞麻總DNA。MgCl2、dNTP、Taq酶及分子質(zhì)量標準購自于天根生化科技有限公司。

表1 試驗所用材料及編號Table1 Name and type of accessions used in the experiment

1.2 EST-SSR序列獲得與引物設(shè)計

從 NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html）下載了2009年11月5日之前提交的7 947條亞麻EST序列，并以FASTA格式保存。利用在線軟件SSRIT（http//www.gramene.org/db/searches/ssrtool）對下載的EST序列進行SSR搜索。搜索標準為：二核苷酸重復次數(shù)≥9，三核苷酸重復次數(shù)≥6，四到六核苷酸重復次數(shù)≥5。

應用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計。引物設(shè)計原則EST序列長度大于100 bp，SSR序列的開始和結(jié)束位置分別距5'和3'端不少于50 bp，引物長度18～24 bp，退火溫度T值40～60℃，而且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃，GC含量40%～60%，PCR擴增產(chǎn)物長度100～500 bp，且盡量避免引物二級結(jié)構(gòu)Dimer、Hairpin、False primer以及連續(xù)6個堿基配對的出現(xiàn)。挑選軟件分析分值在95分以上的引物對，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 PCR體系及SSR擴增條件

PCR反應體系（20 μL）：1×PCR緩沖液，1.25 mmol·L-1Mg2+，1 U Taq聚合酶，0.25 mmol·L-1dNTP，0.25 mmol·L-1SSR引物，50 ng模板DNA。擴增程序為：94℃預變性4 min，94℃變性1 min，各引物最適合退火溫度復性1 min，72℃延伸1 min，35次循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止。應用MJ PTC-100型PCR儀擴增。

1.4 電泳檢測與數(shù)據(jù)處理

6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR反應液中加入5 μL Loading Buffer，94℃變性10 min。電壓1 800 V預電泳30 min，取4 μL變性產(chǎn)物上樣，電泳1 h，硝酸銀染色，照相并統(tǒng)計條帶。利用NTSYS-PC2.10軟件對電泳數(shù)據(jù)進行分析，構(gòu)建聚類圖。應用北京六一廠ECP3000型電泳儀，北京六一廠DYCZ-20D型電泳槽電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻DNA質(zhì)量檢驗結(jié)果

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明提取的亞麻基因組DNA帶型完整，質(zhì)量優(yōu)良能夠滿足后續(xù)試驗要求。將濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng·μL-1，-20℃保存。

2.2 EST序列中SSR分布特點

利用SSRIT軟件在下載的7 947條EST序列中檢索出239條含有SSR的序列，占EST總數(shù)的3.0%。在檢索出EST-SSR序列中，含有二核苷酸重復、三核苷酸重復和四核苷酸重復，未檢索出五、六核苷酸重復。其中三核苷酸重復發(fā)生頻率最高共160條，占檢出總數(shù)的67.0%，其次是二核苷酸重復49條，占檢出總數(shù)的20.5%；四核苷酸重復30條，占檢出總數(shù)12.5%（見表2）。

檢索出的EST-SSR序列重復類型分布有明顯差別，在49條二核苷酸重復中CT（15條）、TA（12條）兩種類型出現(xiàn)頻率最高，其次是AT（7條）和TC（7條）出現(xiàn)頻率相同，共占二核苷酸重復類型總數(shù)的83.7%；在160條三核苷酸重復中TCT（15條）、TAA（14條）、TTC（11條）三種重復類型出現(xiàn)頻率最高，其次是GAA（9條）、CAA（9條）和CTT（9條）出現(xiàn)頻率相同，共占41種三核苷酸重復類型總數(shù)的41.9%；在30條四核苷酸重復中AGAA（19條）為主要重復類型，占11種四核苷酸重復類型總數(shù)的63.3%，其他重復類型除CTTT（2條）外皆出現(xiàn)一次（見表3）。

表2 EST-SSR序列中不同重復核苷酸數(shù)的數(shù)量及百分比Table2 Number and percentage of repeat types in EST-SSR

表3 EST-SSR序列中不同重復類型及其數(shù)量和百分比Table3 Percentage,number and type of SSR in EST-SSR

2.3 EST-SSR標記篩選及多態(tài)性分析

根據(jù)239條EST-SSR序列共設(shè)計了65對引物。在20份亞麻材料中有52對引物能夠擴增出清晰的目的條帶，引物可用率為80%；其中32對引物在不同的亞麻材料間顯示出多態(tài)性，占引物總數(shù)的49.2%。32對引物共擴增出條帶82條，其中多態(tài)性條帶49條，占擴增總條帶的59.8%。在32對具有多態(tài)性的引物中含三核苷酸重復的引物最多23個，二核苷酸重復6個，四核苷酸重復3個。共含有25個重復類型，其中含TC和TCT重復的引物3個；含TA、ATT和ATG重復的引物兩個；含其他重復類型的引物各1個（見表4）。圖1為引物SYES12和引物SYES45在20份亞麻材料中擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果。

2.4 20份亞麻材料聚類分析

結(jié)果見圖2。

表4 亞麻EST-SSR引物序列Table4 Sequences of EST-SSR primers of flax

圖1 引物SYES12（A）和SYES45（B）在20份亞麻材料中擴增結(jié)果Fig.1 Amplification by EST-SSR primers in 20 flax accessions

圖2 20份亞麻材料EST-SSR標記聚類Fig.2 Dendrogram of 20 flax accessions generated by EST-SSR data using UPGMA method

利用篩選出的32個EST-SSR分子標記對20份亞麻材料進行聚類分析，由圖2可知，遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.45～0.89。以0.65為閾值可將20個品種分為五大類，其中16份材料被聚類在第一大類，另外的4個油用品種CN98816、CN97311、CN101131和CN100910分別為一大類，且與第一大類親緣關(guān)系越來越遠。第一大類在0.70處又可被分為三類，S3、 CN101108、 CN10115、 H10、 H12、 H14 和Opaline 7個纖維用品種被首先聚為一類；第二類中包括3個纖維用品種CN98346、CN101114、L28和4 個油用品種 CN10076、CN101352、CN101431、CN101429；第三類包括張亞2號和內(nèi)56這兩個國內(nèi)選育的亞麻品種。從整體來看，聚類圖上半部分的10個品種均為纖維用品種，而10個油用品種全部在下半部分?？梢娎肊ST-SSR分子標記的遺傳多樣性分析可準確的對不同亞麻材料進行親緣關(guān)系鑒定。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明亞麻EST中SSR出現(xiàn)頻率為3%。Kantety等研究發(fā)現(xiàn)，玉米、燕麥和小麥等禾谷類作物SSR出現(xiàn)頻率在7%～10%，水稻4.7%[8]；大豆SSR出現(xiàn)頻率較低，少于1%[6]，主要反映了SSR在不同物種間分布存在差異，也可能是由于搜索標準如重復類型、重復次數(shù)不同，分析方法不同或分析的數(shù)據(jù)量不同導致的。在檢出的亞麻EST-SSR中三核酸重復為主導類型占重復總數(shù)的67%，其次是二核酸重復和四核酸重復，與一般EST序列分析統(tǒng)計結(jié)果相同[9-10]。

多態(tài)性是評價引物的重要指標，本研究開發(fā)的多態(tài)性引物數(shù)量占有擴增條帶的引物總數(shù)49.2%。與已有亞麻EST-SSR引物開發(fā)數(shù)據(jù)有所差異，高于龍松華[11]和Cloutier等[12]研究報道的26.3%和43.3%，但低于張建平等[7]報道的77.8%。這主要與引物多態(tài)性驗證所選擇的亞麻材料本身的遺傳差異大小有關(guān)，前兩者選擇的材料都為常規(guī)材料但遺傳差異較小，而后者雖遺傳差異相對較大卻是由于所選材料中含有雜交材料和不育材料造成的，可見選擇有代表性的多態(tài)性驗證材料對于新引物的開發(fā)有重要意義。其次，引物開發(fā)所用的EST序列來源不同和多態(tài)性條帶的穩(wěn)定性也會影響引物的多態(tài)性比例。由于國內(nèi)外一些研究中開發(fā)的EST-SSR引物并未完全公布，故目前可用的亞麻EST-SSR引物數(shù)有限。本研究公布全部32對具有穩(wěn)定多態(tài)性的EST-SSR引物序列，增加了亞麻可用分子標記數(shù)量，也為今后利用不同cDNA文庫開發(fā)SSR和亞麻遺傳圖譜的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

遺傳多樣性研究的核心是基因多樣性，目前國內(nèi)外亞麻遺傳多樣性研究分析多基于RAPD標記，與之相比EST-SSR標記能夠更好的反應基因表達轉(zhuǎn)錄部分信息。本研究基于EST-SSR分子標記對20份亞麻品種進行的聚類分析可準確的從親緣關(guān)系上區(qū)分油用品種和纖維用品種，驗證了EST-SSR引物在遺傳多樣性分析中的可行性，同時為相關(guān)基因開發(fā)研究提供了有價值資源。

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