雷家軍，吳 超

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，沈陽 110866）

百合是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生草本觀賞花卉。雜交育種尤其是遠(yuǎn)緣雜交育種是百合育種的重要手段，近年推出的百合新品種大部分是利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)育成的[1]。百合種間雜交中不親和性是一個(gè)普遍存在的問題。運(yùn)用花粉管熒光觀察技術(shù)能夠直接判斷高等植物自交與異交過程中花粉管的生長情況，對(duì)研究花粉管生長特性及雜交不親和表達(dá)部位具有重要意義。熒光觀察法簡單方便快速有效，因此國內(nèi)外學(xué)者普遍運(yùn)用這種方法研究果樹、花卉等農(nóng)作物雜交過程中花粉管生長情況[2-5]。本研究運(yùn)用熒光顯微技術(shù)對(duì)三倍體卷丹百合與二倍體及四倍體亞洲百合品種種間雜交后花粉萌發(fā)和生長情況進(jìn)行觀察，初步判斷其正反交的雜交親和性，為克服百合雜交受精前障礙及充分利用我國原產(chǎn)的適應(yīng)性極強(qiáng)的特異三倍體卷丹百合資源奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來自于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地，應(yīng)用野生百合卷丹（Lilium lancifolium Thunb.，2n＝3x＝36）與亞洲百合雜種系品種“多安娜”（Pollyanna，2n＝2x＝24）、“精粹”（Elite，2n＝2x＝24）和“布魯拉諾”（Brunello，2n＝4x＝48）進(jìn)行正反交，共6個(gè)種間雜交組合：①卷丹×多安娜、②卷丹×精粹、③卷丹×布魯拉諾、④多安娜×卷丹、⑤精粹×卷丹、⑥布魯拉諾×卷丹。于授粉后不同時(shí)間取母本花柱及子房作為材料，對(duì)花粉管的生長情況進(jìn)行熒光觀察。

1.2 方法

在母本開花前1 d去雄套袋，開花當(dāng)天將新鮮的父本花粉涂抹于柱頭上，授粉時(shí)間為開花當(dāng)天上午 7:00～10:00，于授粉后 4、8、24、48、72、96、120 h取花柱和子房放入干凈的青霉素小瓶中，每個(gè)組合取3～5個(gè)，用FAA固定液（70%酒精∶冰乙酸∶甲醛＝18∶1∶1）固定、保存。

觀察前將固定液倒掉，用蒸餾水沖洗花柱和子房，加入2 mol·L-1NaOH溶液，放在60℃溫箱中軟化2 h，倒掉堿液，用蒸餾水沖洗3次，加入用0.1 mol·L-1K2HPO4配制的0.1%苯胺藍(lán)溶液，染色2 h以上。觀察時(shí)將花柱連同子房取出，用解剖針將花柱和子房縱向剖開平鋪于載玻片上壓片，用Olympus熒光顯微鏡觀察花粉粒在柱頭上萌發(fā)、花粉管生長及伸向胚珠的情況，測量授粉后不同時(shí)間花粉管長度，并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷丹作母本種間雜交授粉后花粉管熒光觀察

對(duì)卷丹與亞洲百合3個(gè)品種雜交授粉后花粉管生長的熒光觀察，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)品種的花粉均可以在卷丹的柱頭上萌發(fā)。授粉后4 h，3個(gè)組合中多數(shù)花粉粒均已萌發(fā)并且花粉管長出一定長度，部分花粉管已伸出柱頭乳突組織。其中，卷丹×多安娜和卷丹×布魯拉諾兩個(gè)組合的柱頭附著及萌發(fā)的花粉較多，在熒光顯微鏡下可以觀察到明亮的黃綠色（見圖版Ⅰ-A）；卷丹×精粹組合的柱頭附著及萌發(fā)的花粉相對(duì)較少。

授粉后8～24 h，隨著時(shí)間的延長，柱頭上萌發(fā)的花粉數(shù)量增多，花粉管進(jìn)入快速生長期，大量花粉管成束狀向花柱道中延伸（見圖版Ⅰ-B）。其中布魯拉諾的花粉管生長最快、到達(dá)花柱的2/3處（3.62 cm），多安娜次之、花粉管到達(dá)花柱1/2處（2.73 cm），精粹最慢、只延伸到達(dá)花柱的0.20 cm處。

授粉48 h后，多安娜、布魯拉諾的花粉管已進(jìn)入子房，花柱道內(nèi)精粹的花粉管較少，并且有明顯的回折現(xiàn)象；72 h后，布魯拉諾的花粉管到達(dá)子房2/3處（見圖版Ⅰ-C）并到達(dá)胚珠，精粹的花粉管也進(jìn)入子房。本試驗(yàn)中，卷丹×多安娜與卷丹×布魯拉諾組合授粉都能得到一定數(shù)量的有胚種子，而卷丹×精粹沒能得到有胚種子，這與以上熒光觀察的結(jié)果一致。

2.2 卷丹作父本種間雜交授粉后花粉管熒光觀察

2.2.1 多安娜×卷丹授粉后花粉管在花柱中的生長情況

授粉后4 h，花粉粒萌發(fā)很少；8 h花粉管仍纏結(jié)在柱頭表面；24 h花粉管進(jìn)入花柱道內(nèi)但花粉管中出現(xiàn)胼胝質(zhì)；24～72 h花粉管向下伸長，到達(dá)花柱1/3處（1.76 cm），但花柱道內(nèi)的花粉管較少，越向下花粉管越少，同時(shí)出現(xiàn)很多橫向生長、末端膨大異?，F(xiàn)象，花粉管中多處出現(xiàn)胼胝質(zhì)；授粉后96～120 h，僅有極少幾條花粉管到達(dá)花柱基部，胚囊細(xì)胞出現(xiàn)胼胝質(zhì)。兩個(gè)月后田間雜交結(jié)實(shí)調(diào)查表明，這個(gè)雜交組合沒有得到有胚種子。

2.2.2 精粹×卷丹授粉后花粉管在花柱中的生長情況

授粉8～24 h才有少量花粉萌發(fā)；48～72 h花粉管回折異常現(xiàn)象明顯（見圖版Ⅰ-D），同時(shí)花柱道細(xì)胞有胼胝質(zhì)出現(xiàn)（見圖版Ⅰ-E）；96～120 h，多數(shù)花粉管到達(dá)花柱1/5～1/4處（0.95～1.19 cm），僅極少量花粉管（0～3條）可伸長至花柱基部，到達(dá)子房，但沒有觀察到花粉管到達(dá)胚珠。兩個(gè)月后田間雜交結(jié)實(shí)調(diào)查表明，這個(gè)雜交組合也沒有得到有胚種子。

2.2.3 布魯拉諾×卷丹授粉后花粉管在花柱中的生長情況

授粉4～8 h后花粉粒萌發(fā)，表現(xiàn)正常；授粉后24 h，花粉管在柱頭表面出現(xiàn)明顯橫向生長異?，F(xiàn)象；24～72 h花粉管在花柱道內(nèi)回折、纏繞（見圖版Ⅰ-F）；72～120 h大多花粉管到達(dá)花柱1/2處（2.56 cm），少量花粉管進(jìn)入子房到達(dá)胚珠。2個(gè)月后得到少量膨大蒴果和有胚種子。

圖版Ⅰ 卷丹與亞洲百合種間雜交授粉后花粉管生長熒光觀察PlateⅠ Fluorescence observation of pollen tube growth from interspecific hybridization between Lilium lancifolium Thunb.and Asiatic lilies

3 討論與結(jié)論

3.1 卷丹與亞洲百合種間雜交親和性

三倍體卷丹與亞洲百合二倍體和四倍體品種的正反交試驗(yàn)中，卷丹作母本時(shí)雜交親和性較高，在卷丹×多安娜與卷丹×布魯拉諾兩個(gè)組合中得到了膨大的果實(shí)和有胚種子，表明卷丹是很好的母本材料。卷丹作父本時(shí)，花粉在授粉后4～24 h內(nèi)雖能萌發(fā)形成花粉管，但在48～96 h觀察到很多異常橫向生長的花粉管，120 h時(shí)發(fā)現(xiàn)極少有花粉管穿過整個(gè)花柱到達(dá)子房，雜交親和性差，未能得到有胚種子。因此，在以卷丹為父本的雜交組合中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)授粉方法的研究，可以試驗(yàn)重復(fù)授粉、應(yīng)用植物生長調(diào)節(jié)劑等方法促進(jìn)子房膨大[6-9]，以期得到有胚種子。

3.2 種間雜交的花粉管異?，F(xiàn)象

通過觀察花粉管的生長狀態(tài)有助于判斷雜交是否親和。有研究表明，多種植物雜交時(shí)花粉管生長均出現(xiàn)異常行為，主要表現(xiàn)在：花粉不能在異種柱頭上萌發(fā)；花粉雖能萌發(fā)，但存在著延遲阻礙，花粉管扭曲盤繞，不能或只有少量進(jìn)人柱頭；花粉管進(jìn)人柱頭后由于花粉管先端或全部沉積胼胝質(zhì)而停止生長或纏繞、分叉、先端膨大、變小等異?，F(xiàn)象導(dǎo)致生長緩慢甚至破裂；花粉管雖正常生長，但由于長度不夠而不能達(dá)到子房完成受精；花粉管即使達(dá)到子房，雌雄配子不能受精形成合子或只有卵核或極核發(fā)生單受精[10-15]。本試驗(yàn)對(duì)不同百合種間雜交組合花粉管在花柱內(nèi)生長情況的熒光顯微觀察發(fā)現(xiàn)，花粉基本都能萌發(fā)，萌發(fā)后花粉管穿過柱頭，進(jìn)入花柱，但不同雜交組合的花粉萌發(fā)量和花粉管伸長存在差異，并且存在生長異常的花粉管，主要有4種異常現(xiàn)象：一是花粉管在末端出現(xiàn)膨大；二是花粉管橫向生長普遍；三是花粉管出現(xiàn)回折、纏繞；四是花粉管生長過程中出現(xiàn)大量胼胝質(zhì)，出現(xiàn)的部位有花粉管、花柱道細(xì)胞、胚囊。王文和等觀察百合遠(yuǎn)緣雜交時(shí)認(rèn)為，“Bernini”柱頭乳突細(xì)胞是阻礙“Pollyanna”花粉管生長的第一道屏障，花柱道細(xì)胞是抑制花粉管在花柱內(nèi)生長的第二道屏障[16]；李守麗等觀察到大百合與百合屬間雜交后花粉萌發(fā)與花粉管的伸長速度相對(duì)于自交滯后，個(gè)別花粉管出現(xiàn)末端分叉、膨大、變細(xì)或中間部分折疊，花粉管內(nèi)胼胝質(zhì)不規(guī)則大量沉積等現(xiàn)象[17]。雖然雜交親和性與花粉管的行為有關(guān)，但雜交的成功與否還受到受精后諸多因素的影響，還需要從胚胎學(xué)和遺傳學(xué)方面進(jìn)一步探討。

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