王 長 偉, 陳 敏, 李 家 桐, 孫 玉梅, 張 瑤 瑤

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 紡織與材料工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

生物固定化技術(shù)是現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域中的一項新興技術(shù)。載體材料的選擇及表面改性方法是該技術(shù)的關(guān)鍵。載體材料應(yīng)自身帶有或通過表面改性產(chǎn)生能與固定化物反應(yīng)的官能團(tuán),比表面積大、機(jī)械剛性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、耐微生物降解等。適于生物固定化的載體種類很多,如天然高分子材料、合成高分子材料、無機(jī)材料、復(fù)合材料和新型材料[1]等,其中無機(jī)材料中應(yīng)用較多的是硅藻土、多孔玻璃、玻璃纖維等。玻璃纖維用作載體材料的研究集中在兩個方面,一是研制兼具高比表面積和高力學(xué)強(qiáng)度的多孔玻璃纖維,根據(jù)活性材料類型采用傳統(tǒng)方法直接把活性材料沉積在纖維表面上[2]；另一種則是以玻璃纖維為底,通過表面改性沉積活性材料[2]。玻璃纖維的表面改性方法主要有偶聯(lián)劑改性[3-4]、等離子體改性[5]、稀土元素改性[6]和表面二次接枝改性[7]等。前人研究多集中在偶聯(lián)劑改性在復(fù)合材料中的應(yīng)用,本文將著重研究偶聯(lián)劑改性制備生物固定化載體,討論了該過程中不同工藝條件對玻璃纖維自身改性效果及改性玻璃纖維對脂肪酶固載率的影響。

1 實 驗

1.1 實驗材料

所用載體材料為E-玻璃纖維織物,重慶國際復(fù)合材料有限公司；硅烷偶聯(lián)劑為γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH-550)和γ-縮水甘油基丙基三甲氧基硅烷(KH-560),遼寧蓋州化學(xué)工業(yè)有限責(zé)任公司；固定化酶為LVK-F100脂肪酶,深圳市綠維康生物工程有限公司。

1.2 固定化載體的制備

載體的制備主要是通過對玻璃纖維織物的偶聯(lián)劑改性來完成的,硅烷偶聯(lián)劑水解生成的硅醇基和玻璃纖維表面的羥基反應(yīng)而連接。為了盡可能增加玻纖表面羥基數(shù)量,提高反應(yīng)效率,實驗采用堿預(yù)處理和偶聯(lián)劑改性相結(jié)合的方法對玻璃纖維進(jìn)行改性。將經(jīng)過清洗的玻璃纖維織物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的NaOH溶液預(yù)處理30 min,去離子水沖洗至洗液呈中性,干燥后浸于一定濃度的硅烷偶聯(lián)劑水溶液中一段時間,取出置于恒溫干燥箱中120 ℃下烘干,冷卻制得固定化載體。

1.3 載體固定化脂肪酶

按1 g脂肪酶與10 mL去離子水的比例配置酶液,將改性前后玻璃纖維織物樣品,分別浸漬在等量酶液中,置于搖床上固定化2 h (溫度為30 ℃,轉(zhuǎn)速為160 r/min)。

1.4 載體性能測試

用JYSP-360a型接觸角測定儀測定了玻璃纖維織物改性前后對去離子水接觸角(θ)的變化,以表征偶聯(lián)劑改性對載體表面潤濕性的影響；用 Spectrum One-B型傅里葉變換紅外光譜儀測定玻璃纖維表面官能團(tuán)的變化,以表征載體表面微結(jié)構(gòu)的變化；以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)液,采用Bradford法[8]測定載體對脂肪酶固定化前后酶液中蛋白質(zhì)含量,計算出脂肪酶固載率,通過固載率的變化表征偶聯(lián)劑對玻璃纖維的改性效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 玻璃纖維表面潤濕性的變化

2.1.1 不同試劑處理對接觸角的影響

在前人研究[9-10]和前期實驗的基礎(chǔ)上,本實驗采用NaOH預(yù)處理玻璃纖維以增加其表面參與反應(yīng)的羥基數(shù)量,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%,處理時間為 30 min；偶聯(lián)劑改性則用體積分?jǐn)?shù)為3%的KH-550、KH-560水溶液處理10 min。玻璃纖維樣品分別經(jīng)過不同處理所得接觸角如表1,其中所列試劑均包含選定的濃度和時間。

表1 不同試劑處理對接觸角的影響

由表1可以看出,經(jīng)各種試劑處理后接觸角都比空白樣明顯增大,NaOH預(yù)處理和硅烷改性的協(xié)同處理對玻璃纖維表面的潤濕性改變效果最顯著,明顯優(yōu)于任何一種試劑單獨處理。主要是由于NaOH中的 OH-離子破壞表面硅氧骨架,同時Na+對玻纖表面吸附能力較強(qiáng),形成的硅酸鈉溶解度很大[11]；NaOH使玻纖表面產(chǎn)生了更多的反應(yīng)性基團(tuán)-羥基,有利于提高玻纖與硅烷偶聯(lián)劑鍵接數(shù)量和效率。另外,從表1還可看出兩種偶聯(lián)劑對玻璃纖維潤濕性的改變效果相近。這可從偶聯(lián)劑的改性機(jī)理來解釋,硅烷偶聯(lián)劑含有兩種不同的化學(xué)官能團(tuán),一端親無機(jī)物,另一端親有機(jī)物。親無機(jī)端能水解生成硅醇,與表面帶有羥基的玻璃纖維表面通過氫鍵相連[12]；親有機(jī)端則可與各種有機(jī)官能團(tuán)生成穩(wěn)定共價鍵,從而起到偶聯(lián)效果。兩種偶聯(lián)劑水解生成的硅醇數(shù)量相同,故改性效果非常接近。

2.1.2 硅烷偶聯(lián)劑溶液浸漬時間對潤濕性的影響

將經(jīng)預(yù)處理的樣品浸于體積分?jǐn)?shù)為3% 的KH-550和KH-560溶液中不同時間,得到不同浸漬時間對玻璃纖維表面潤濕性的影響如圖1所示。

圖1 偶聯(lián)劑溶液浸漬時間對接觸角的影響

Fig.1 The effect of dipping time of coupling agent on contact angle

由圖1可見,接觸角在0～10 min內(nèi)隨著時間的增長迅速增大,10 min后增大趨勢趨于平穩(wěn),可見硅烷偶聯(lián)劑對玻璃纖維表面改性效果在10 min 時就可達(dá)到非常高,而之后隨著時間的延長表面性質(zhì)已無明顯變化,因而本實驗工藝條件下浸漬時間選擇10 min。

2.1.3 硅烷偶聯(lián)劑溶液體積分?jǐn)?shù)對潤濕性的影響

將經(jīng)預(yù)處理的樣品浸于不同體積分?jǐn)?shù)的KH-550和KH-560溶液中10 min,偶聯(lián)劑的種類和溶液體積分?jǐn)?shù)對潤濕性的影響趨勢如圖2所示。

圖2 偶聯(lián)劑溶液體積分?jǐn)?shù)對接觸角的影響

Fig.2 The effect of concentration of coupling agent to contact angle

由圖2可見,接觸角在溶液體積分?jǐn)?shù)為3%以內(nèi)隨著體積分?jǐn)?shù)的增大而迅速變大,且在同一體積分?jǐn)?shù)下KH-560改性后的接觸角比KH-550大；大于3%時,接觸角隨體積分?jǐn)?shù)增大而減小,同一體積分?jǐn)?shù)下KH-550改性后的接觸角比KH-560大。這說明兩種不同偶聯(lián)劑對潤濕性的影響趨勢相同,只是程度有異,本實驗工藝條件下選定偶聯(lián)劑溶液體積分?jǐn)?shù)為3%。

2.2 玻璃纖維表面官能團(tuán)的變化

將玻璃纖維經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的NaOH溶液預(yù)處理30 min,再分別在體積分?jǐn)?shù)為3%的KH-550和KH-560溶液中處理10 min,所得樣品進(jìn)行紅外光譜測試,紅外譜圖見圖3、4。由圖3可以看出,經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為3%的KH-550改性后樣品在1 630 cm-1處物理吸附水的紅外吸收峰消失,純KH-550在1 080 cm-1附近的Si—O振動峰[13]雖在改性后玻璃纖維上消失,但在2 930 與2 854 cm-1處 —CH3和 —CH2— 吸收峰明顯增強(qiáng)[14],這說明玻璃纖維表面已接上一定量的硅烷。由圖4可看出,KH-560改性后玻璃纖維在2 925 和2 855 cm-1附近出現(xiàn)了 —CH3和 —CH2— 伸縮振動峰[15],1 450 cm-1處吸收峰增強(qiáng),這表明KH-560與玻璃纖維表面已形成一定的化學(xué)鍵連接。由此可知,KH-550和KH-560均能通過一定的化學(xué)鍵連接到玻璃纖維表面。

a,KH-550；b,未處理樣品；c,KH-550處理后樣品

圖3 KH-550及改性前后玻璃纖維的紅外光譜圖

Fig.3 Infrared spectrum of surface-modified and unmodified glass fiber and KH-550

a,KH-560；b,未處理樣品；c,KH-560處理后樣品

圖4 KH-560及改性前后玻璃纖維的紅外光譜圖

Fig.4 Infrared spectrum of surface-modified and unmodified glass fiber and KH-560

2.3 表面改性對生物固定化效率的影響

將玻璃纖維織物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的NaOH溶液預(yù)處理30 min,再分別在體積分?jǐn)?shù)為3%的KH-550和KH-560溶液中處理10 min,所得樣品進(jìn)行脂肪酶固定化,測得固定化前后酶液的吸光度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定酶液中蛋白質(zhì)含量,計算脂肪酶固載率,所得數(shù)據(jù)見表2。

表2 偶聯(lián)劑改性對脂肪酶固定化的影響

Tab.2 Effect of different coupling agents on lipase immobilization

吸光度固載率/%固定化前酶液未改性玻纖固定化后酶液KH-550改性玻纖固定化后酶液KH-560改性玻纖固定化后酶液0.4950.4670.4290.382—14.033.056.5

由表2可以看出,經(jīng)兩種偶聯(lián)劑改性都能大幅提高玻璃纖維對脂肪酶的固載率,且KH-560改性對固載率的提高幅度又明顯大于KH-550,這可能與硅烷偶聯(lián)劑的種類、結(jié)構(gòu)及有機(jī)官能團(tuán)與酶的匹配有關(guān)。

3 結(jié) 論

采用硅烷偶聯(lián)劑通過浸漬法對經(jīng)預(yù)處理過的玻璃纖維表面進(jìn)行了偶聯(lián)劑改性,制備了固定化載體并對脂肪酶進(jìn)行了固定化,探討了不同工藝參數(shù)對載體表面潤濕性能的影響,通過接觸角測量、紅外光譜測試及脂肪酶固載率的測試來表征改性后性能改善情況。研究表明:

(1) 玻璃纖維偶聯(lián)劑改性可制備出性能明顯改善的固定化載體。

(2) 硅烷偶聯(lián)劑種類、溶液的體積分?jǐn)?shù)及浸漬時間對玻璃纖維表面性能都有不同程度影響,本實驗條件下選定的工藝為體積分?jǐn)?shù)為3%,浸漬時間10 min。

(3) 改性后載體表面潤濕性能明顯改善,表面官能團(tuán)明顯變化,且對脂肪酶固定化效果明顯提高。

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