王貴華，王美君，湯 波，陳義峰，趙亞榮

(北京大北農(nóng)動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100097)

斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post－weaning multi－systemic wasting syndrome，PMWS)主要是由豬圓環(huán)病毒2型(PCV－2)引起。豬圓環(huán)病毒有PCV－1和PCV－2兩種基因型，PCV－1不具有致病性，但在正常血清中廣泛存在。ORF1編碼Rep蛋白，是引起PCV兩個(gè)血清型之間抗原交叉反應(yīng)的主要原因，因此只能用于鑒別PCV［1］。ORF2編碼病毒衣殼蛋白(Cap蛋白)，具有很強(qiáng)的免疫原性，在兩型之間不存在抗原交叉反應(yīng)。因此Cap蛋白可作為PCV－2抗體檢測的首選抗原［2－7］。本文通過表達(dá)的Cap蛋白，結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)，建立PCV－2抗體膠體金檢測試紙條，為養(yǎng)豬場開展PCV－2抗體監(jiān)測提供簡便方法。

1 材料與方法

1．1 材料 氯金酸、檸檬酸三鈉試劑購自北京化學(xué)試劑公司;PCV－2抗原(Cap蛋白，為原核表達(dá)產(chǎn)物)、針對PCV－2Cap蛋白的PCV－2單抗由北京大北農(nóng)動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心制備保存;硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜、PVC板、吸水紙均購自上海捷寧生物科技有限公司;PCV－2抗體ELISA檢測試劑盒購自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司;PCV－2、PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合征病毒)血清由本實(shí)驗(yàn)室保存，PCV －1、CSFV(豬瘟病毒)、PRV(豬偽狂犬病毒)、PPV(豬細(xì)小病毒)等陽性血清由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1．2 PCV－2抗體檢測試紙條的制備

1．2．1 膠體金的制備 用檸檬酸三鈉還原法制備濃度為萬分之四的膠體金溶液;

1．2．2 膠體金的標(biāo)記 量取膠體金50mL，將膠體金調(diào)節(jié)pH值至9．0，攪拌并加入Cap蛋白1．2 mg，繼續(xù)攪拌30 min，加入20%的PEG－2000終止反應(yīng)，10000 r/min離心10 min，取沉淀，再用金標(biāo)緩沖液溶至50 mL，備用。

1．2．3 冷凍干燥 將標(biāo)記好的膠體金溶液均勻噴涂在玻璃纖維膜上，冷凍干燥后備用。

1．2．4 抗原抗體包被 把PCV－2抗原和PCV－2單抗分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線T和對照線C，干燥備用。

1．2．5 試紙的制備 把膠體金包被好的硝酸纖維素膜、吸水紙、加樣區(qū)玻璃纖維素膜按順序貼到PVC板上，切割成條，分裝鋁箔袋，袋內(nèi)裝入干燥劑，密封，常溫保存。

1．3 樣品檢測及判定標(biāo)準(zhǔn) 將試紙條放在水平操作臺(tái)上，取100μL血清滴加到樣品孔，在室溫下靜置，15 min內(nèi)觀察結(jié)果。若在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶而在檢測線處不出現(xiàn)紅線條帶，說明樣品為陰性;若在檢測線和指控線處均出現(xiàn)紅色條帶，說明樣品為陽性;若在質(zhì)控線不出現(xiàn)紅色條帶，說明實(shí)驗(yàn)不成立，需重新取試紙條進(jìn)行檢測。判定標(biāo)準(zhǔn)見圖1。

圖1 試紙條判定標(biāo)準(zhǔn)

1．4 試紙條的評估

1．4．1 與 ELISA商品化試劑盒的符合率 用ELISA檢測試劑盒和試紙條同時(shí)檢測從豬場采集的38份疑似PCV－2血清，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并計(jì)算試紙條的符合率。

1．4．2 試紙條的敏感性 將標(biāo)準(zhǔn)陽性血清倍比稀釋，觀察試紙條的檢測結(jié)果。

1．4．3 試紙條的特異性 用膠體金試紙條檢測PCV －1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV 陽性血清，觀察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果

2．1 結(jié)果判定 在質(zhì)控線和檢測線處均出現(xiàn)紅色條帶，樣品為陽性;在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶而在檢測線處不出現(xiàn)紅色條帶，樣品為陰性;在質(zhì)控線不出現(xiàn)紅色條帶，說明試驗(yàn)失敗，需重新取試紙條檢測;可疑樣品需重新檢測并與ELISA試劑盒作比較。結(jié)果見圖2。

圖2 試紙條結(jié)果判定

2．2 符合率 取38份豬血清，分別用檢測試紙條和ELISA試劑盒(武漢科前)進(jìn)行PCV－2抗體水平檢測，符合率為94．7%，結(jié)果見表1。

表1 與ELISA商品化試劑盒對比結(jié)果

2．3 敏感性 將PCV－2陽性血清用PBS倍比稀釋成1:2、1:4、1:8、1:16，再用 ELISA 試劑和試紙條進(jìn)行PCV－2抗體水平測定，結(jié)果見表2。

表2 敏感性檢測結(jié)果

2．4 特異性 通過對 PCV －1、PRRSV、CSFV、PRV、PPV陽性血清進(jìn)行檢測。結(jié)果表明用試紙條檢測豬血清中的 PCV－2抗體時(shí)，與 PCV－1、PRRSV、CSFV、PRV、PPV等血清無明顯的交叉反應(yīng)，結(jié)果見表3。

表3 特異性檢測結(jié)果

3 討論

近年來，膠體金免疫層析技術(shù)廣泛應(yīng)用于激素或多種疾病相關(guān)蛋白的檢測、病原的抗原抗體檢測、藥物濃度的檢測、食品和環(huán)境中相關(guān)物質(zhì)的檢測等方面［8－12］。本研究用膠體金標(biāo)記技術(shù)，將膠體金標(biāo)記PCV－2Cap蛋白，結(jié)合單克隆抗體又有良好的特異性和敏感性，建立了一種快速檢測PCV－2抗體的膠體金免疫層析方法。檢測陽性樣品時(shí)，樣品中的PCV－2抗體同膠體金標(biāo)記的金標(biāo)抗原結(jié)合物反應(yīng)，形成復(fù)合物并沿層析條向前移行，液體移行至檢測線包被區(qū)時(shí)，與預(yù)包被的PCV－2抗原形成抗原抗體復(fù)合物而凝聚顯色。游離膠體金標(biāo)記的PCV－2抗原則在對照線處與PCV－2單抗結(jié)合而富集顯色;對于陰性樣本，由于沒有PCV－2抗體存在，在檢測線區(qū)將不會(huì)出現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物而顯色，僅在對照線處顯色。

試紙條采用的抗原PCV－2Cap蛋白是大腸桿菌表達(dá)的可溶性蛋白經(jīng)純化后的產(chǎn)物。通過基因工程方法可以生產(chǎn)大量廉價(jià)的生物活性蛋白。對照線處包被的針對PCV－2Cap蛋白的單克隆抗體，具有良好的特異性和敏感性，保證了實(shí)驗(yàn)的有效性，而且單克隆抗體也可以用體外培養(yǎng)法大量生產(chǎn)，這就大大降低了試紙條的生產(chǎn)成本。

豬圓環(huán)病毒2型抗體免疫金標(biāo)檢測試紙條，不需要實(shí)驗(yàn)室和儀器設(shè)備，只要將待測血清加入加樣孔內(nèi)，平放，室溫靜置15 min，即可觀察檢測結(jié)果。本試紙條與ELISA方法相比，快速、簡便、成本低、可操作性強(qiáng)，很適合基層養(yǎng)豬場進(jìn)行抗體的實(shí)時(shí)監(jiān)測，給養(yǎng)豬生產(chǎn)提供便利條件。

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