孫啟強，蘭 斌，陳彥超

(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，福建福州350005)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，隨著居民飲食結構、生活環(huán)境的改變及診斷水平的提高，其檢出率有逐年升高的趨勢。增殖細胞核抗原67(proliferating cell nuclear antigen 67，Ki-67)和胸苷激酶1(thymidine kinase 1，TK1)在多種腫瘤組織中都有表達，兩者與腫瘤的發(fā)生、進展等生物學行為均有密切關系，本文通過對胃癌、正常胃組織中兩者表達的比較研究，探討兩者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及相互關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2009年至2011年手術切除、術后病理證實為胃癌的標本71例，其中男性53例，女性18例;平均年齡61歲;全部患者術前均未接受過放化療。組織學分型:高、中分化腺癌30例，低、未分化腺癌41例;浸潤深度:黏膜層及肌層23例，達到或穿透漿膜層48例;有淋巴結轉移42例，無淋巴結轉移29例;TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期19例，Ⅲ、Ⅳ期52例。另隨機抽取門診胃鏡檢查正常胃組織標本20例作為對照組。

1.2 主要試劑 TK1鼠抗人單克隆抗體，克隆號F12，稀釋度1∶400，購自 Abnova 公司;Ki-67，鼠抗人單克隆抗體，克隆號MB1，稀釋度1∶200，購自中山金橋公司;二抗(Envision 2步法鼠/兔通用型試劑盒k5007)均購自中山金橋公司。

1.3 實驗方法 將以上病例參照相關文獻步驟［1］，進行組織免疫組化染色，相同病例做平行標本2例，并設置陰性對照。切片厚度4 μm備用。免疫組化采用Envision 2步法，以枸櫞酸鈉(pH 6.0)為修復液，高壓鍋抗原熱修復，高壓保持2 min;其余步驟按常規(guī)Envision法進行，DAB顯色，蘇木精復染。用PBS代替一抗設立空白對照。

1.4 結果判定 TK1為細胞質著色，Ki-67為細胞核著色。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPPS 13.0進行統(tǒng)計處理，各組間計數(shù)資料的比較采用 χ2檢驗，相關分析采用Spearman分析，檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 胃癌組織、正常胃組織中Ki-67和TK1的表達兩者在胃癌組織中的表達水平明顯高于正常胃組織，差異有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。Ki-67陽性染色位于細胞核中，TK1陽性染色位于細胞質中。見表1，圖1、2。

2.2 Ki-67和TK1的表達與胃癌各臨床病理參數(shù)的關系 Ki-67和TK1的表達與胃癌的病理分級無關(P＞0.05);Ki-67的表達與胃癌的腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移以及TNM分期有關(P均＜0.05);TK1的表達與胃癌的腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移以及TNM分期無關(P均 ＞0.05)。見表2。

2.3 胃癌組織中 TK1與 Ki-67表達的關系Spearman相關分析顯示，胃癌組織中TK1與Ki-67的表達呈正相關關系(r=0.383，P=0.001)。見表3。

表1 Ki-67和TK1在胃癌組織和正常胃組織中的表達

3 討論

胃癌在我國是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤首位。胃癌多見于男性，男女之比約為2∶1。平均死亡年齡為61.1歲。胃癌細胞的增殖、分裂失調是腫瘤發(fā)生的基礎，觀測細胞增殖強度和指數(shù)有助于評估腫瘤的性質。TK1作為研究細胞增殖程度的新的標志物，其與Ki-67的細胞增殖周期特征不同，主要在S期表達并定位于細胞質，而Ki-67表達于除G0期外的各期。TK1是一種特殊激酶，催化胸苷轉變?yōu)橐涣姿嵝剀账?，是癌變細胞DNA合成必須的前體物。在細胞增殖過程中，其催化脫氧核糖尿嘧啶核苷合成單磷酸脫氧核糖尿嘧啶核苷，然后在其他相關磷酸激酶的作用下，合成三磷酸脫氧核糖尿嘧啶核苷，參與DNA合成［2］。Morimoto等［3］對肝臟部分切除后大鼠血清TK1進行檢測，發(fā)現(xiàn)在大鼠手術恢復期，其肝臟TK1活性明顯增高，從而證實其在細胞增殖過程中的作用。TK的2種同工酶TK1、TK2分別定位于細胞質和細胞核。增殖周期中的TK1含量自細胞分裂G1期合成開始增加，在S期逐漸升高，至G2期達到最高［4］。胃癌的發(fā)生就是正常胃黏膜在各種損傷因子的作用下，導致黏膜活性大大增強。因此，通過檢測血清TK1和正常胃黏膜上皮細胞的細胞質內TK1含量和表達強度，就有可能為判斷胃癌黏膜內上皮細胞從良性到惡性變化、從量變到質變的過程和狀態(tài)提供了依據(jù)。

表2 Ki-67、TK1在胃癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)的關系

表3 Ki-67、TK1在胃癌組織中表達的相關性

TK1在血清學的檢測中應用廣泛，且相關報道較多［5］，但其免疫組化方面的研究尚較少。本文應用免疫組化方法檢測71例胃癌、20正常胃黏膜組織中的TK1及Ki-67的表達，進而研究TK1在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及TK1與Ki-67兩者之間的相關性;同時研究TK1在評價患者預后中的作用。結果顯示，胃癌組織中TK1的陽性表達率明顯高于正常胃組織，提示過表達的TK1可能與胃黏膜過度增殖和惡性轉化有關;對TK1的表達情況與胃癌的各臨床病理參數(shù)的關系進行分析，發(fā)現(xiàn)TK1表達與胃癌的病理分級、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期無關，提示TK1的過量表達與胃癌發(fā)生有關，但對于判斷其進展及預后意義不明顯，這有助于早期發(fā)現(xiàn)胃癌。這與相關文獻報道TK1在大腸癌中的檢測結果一致［6］。

Ki-67是一種與細胞周期有關的蛋白質，Ki-67是目前多種惡性腫瘤尤其是乳腺癌研究中的生物指標，在其他腫瘤檢測中也常應用［7］，可以通過Ki-67的檢測，了解惡性腫瘤的細胞增殖活性。Ki-67高表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有重要關系，Ki-67的表達與胃癌的病理分級、浸潤深度、有無淋巴結轉移及TNM分期關系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67在胃癌組織中的表達顯著高于正常胃組織，達到或穿透漿膜層者高于侵犯黏膜層和肌層，有淋巴結轉移者高于無淋巴結轉移者，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期者高于Ⅰ、Ⅱ期者，提示在胃癌組織中，病理分化越差，細胞惡性程度越高;病程越晚，增生越活躍，則Ki-67表達水平越高。Ki-67在某些良、惡性疾病間的表達有一些交叉，有些良性病變的 Ki-67指數(shù)甚至高于某些惡性病變［8］，因此單獨依靠 Ki-67來鑒別這些疾病時應慎重。TK1和Ki-67在增殖指數(shù)及其與臨床病理參數(shù)的關系方面表現(xiàn)出共同的特征，但相對于Ki-67而言，TK1在腺癌中是一種更可靠的增殖相關標志物。因此可以通過聯(lián)合檢測TK1和Ki-67來觀測腫瘤的增殖程度、生物學性質以及輔助病理學診斷。另外在方法學檢測的優(yōu)勢上，TK1表現(xiàn)出細胞質定位特征的免疫組化原位檢測要比其他檢測方法更精準［9］。

［1］張毅敏，單綠虎，徐笑紅.細胞質胸苷激酶1在106例腫瘤病人的表達［J］.中國腫瘤，2008，17(3):247 －248.

［2］Zhang F，Li H，Pendleton AR，et al.Thymidine kinase 1 immunoassay:a potential marker for breast cancer T［J］.Cancer Detect Prev，2001，25(1):8 －15.

［3］Morimoto M，Numata K，Tanaka K.Rat peripheral mononuclear cell thymidine kinase activity increases during liver regenerative processes after partial hepatectomy［J］.J Gastroenterol Hepatol，1995，10(6):655－661.

［4］He Q，Skog S，Wang N，et al.Characterization of a peptide antibody against a C-terminal part of human and mouse cytosolic thymidine kinase，which is a marker for cell proliferation［J］.Eur J Cell Biol，1996，70(2):117 －124.

［5］Brockenbrough JS，Rasey JS，Grierson JR，et al.A simple quantitative assay for the activity of thymidine kinase 1 in solid tumors［J］.Nucl Med Biol，2007，34(6):619 －623.

［6］吳鴻雁，樊祥山，孟凡青，等.TK1、Ki-67在大腸癌發(fā)生發(fā)展中作用及其相關性［J］.臨床與實驗病理學雜志，2009，25(3):282－286

［7］Mao Y，Wu J，Wang N，et al.A comparative study:immunohistochemical detection of cytosolic thymidine kinase and proliferating cell nuclear antigen in breast cancer［J］.Cancer Invest，2002，20(7/8):922－931.

［8］Mao Y，Wu J，Skog S，et al.Expression of cell proliferating genes in patients with non-small cell lung cancer by immunohistochemistry and cDNA profiling［J］.Oncol Rep，2005，13(5):837 －846.

［9］Zhang F，Shao X，Li H，et al.A monoclonal antibody specific for human thymidine kinase 1［J］.Hybridoma，2001，20(1):25 －34.