胡圣偉，倪 偉，陳創(chuàng)夫，賽務加甫，務熱力·哈孜，郭吉星

(1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832000;2.石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 832000)

目前，通過體細胞核移植技術(shù)己經(jīng)成功培 育 出 綿 羊[1]、牛[2]、山 羊[3]、豬[4]、大鼠[5]、騾子[6]和狗[7]等多種哺乳動物，尤其是在利用該技術(shù)成功獲得具有一定性狀的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊、牛和豬后，顯示出這一技術(shù)誘人的應用前景。但是，體細胞克隆動物在孕期流產(chǎn)率較高，只有少數(shù)能發(fā)育到妊娠末期或成年，即使存活的克隆動物也存在一些健康和器官發(fā)育異常的問題。研究發(fā)現(xiàn)很多克隆動物的發(fā)育異常都與其胎盤發(fā)育缺陷相關[8]。克隆綿羊胎盤發(fā)育缺陷導致大量胚胎在妊娠階段發(fā)育停滯或流失，胎盤表現(xiàn)出子葉數(shù)量減少和血管系統(tǒng)發(fā)育缺陷等問題[9]。因此，胎盤發(fā)育缺陷是導致克隆動物效率低下的重要原因之一。然而，目前克隆動物胎盤發(fā)育異常的分子機制尚不清楚。

MicroRNA(miRNA)是近幾年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA分子，其在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達[10]。miRNA參與細胞的增殖、分化和凋亡等過程，在胚胎和胎盤發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[11]。miR-127和miR-136是兩個位于印記基因retrotransposon-like(Rtl1)的GC島附近的miRNA，而Rtl1是一個在胎盤發(fā)育過程中起到重要調(diào)控作用的關鍵基因[12]。Cui等[13]發(fā)現(xiàn)，在克隆小鼠囊胚中 miR-127的表達量及其啟動子甲基化水平顯著異常，證實miR-127在體細胞克隆小鼠胚胎中未被正確重編程。推測miR-127的不完全重編程可能導致克隆動物胎盤發(fā)育缺陷。然而，miR-127和miR-136是否在克隆動物胎盤中異常表達及其作用機制還未見報道。

在本研究中，運用熒光定量PCR比較了miR-127和miR-136分別在死亡克隆綿羊和普通對照綿羊胎盤中的相對表達量，并運用EGFP熒光報告系統(tǒng)鑒定miR-127和miR-136的靶基因，分析了靶基因在克隆胎盤中的表達情況。結(jié)果表明，在克隆綿羊胎盤中miR-127和miR-136基因表達量顯著高于對照綿羊胎盤中的表達量，miR-127和miR-136模擬物可顯著降低Rtl1-EGFP融合基因在細胞中的表達，初步證實Rtl1是miR-127和miR-136的靶基因，并且在克隆綿羊胎盤中的表達量降低了3/5。這些發(fā)現(xiàn)為從microRNA角度揭示克隆動物胎盤發(fā)育異常的分子機制奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

綿羊卵巢采集于烏魯木齊市屠宰場，4 h內(nèi)于20～25℃生理鹽水中送回實驗室用于收集綿羊卵母細胞。以40 d的細毛羊胎兒成纖維細胞為核移植的供體細胞。用于對照組的正常受精產(chǎn)生的綿羊胎盤來自石河子大學實驗場。

1.1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP，凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒小量制備純化試劑盒和Genomic DNA Kit購自北京 TianGen公司;DNA marker，SYBR Green，PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自takara公司;小RNA分離試劑、熒光定量PCR試劑盒購自Ambion公司。DMEM/F12、胎牛血清購自Gibco公司;miR-127 minics、miR-136 minics和熒光定量PCR引物由Ambion公司合成。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因克隆綿羊的生產(chǎn)

靶向綿羊肌肉生長抑制素的shRNA表達載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及陽性細胞的篩選[14，15]。卵母細胞的采集與體外成熟培養(yǎng)、體細胞核移植程序[16，17]。2010 年，本研究組共獲得 2只肌肉生長抑制素基因敲的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊。其中1只在出生后即死亡，另一只存活23 d后死亡。選取死亡的2只轉(zhuǎn)基因綿羊的胎盤作為實驗組(D1和D2)。該組羔羊都表現(xiàn)有不同程度的發(fā)育異常。D1存在呼吸問題，胎盤肥大;D2為死胎，胎盤肥大，剖解未見器官異常。另外采集2只普通健康的細毛羊胎盤作為對照組。轉(zhuǎn)基因綿羊通過PCR和Southern blotting鑒定(另文發(fā)表)。

1.2.2 miR-127和miR-136的熒光定量PCR

采用stem-loop qRT-PCR定量分析microRNA的表達量[18]。收集克隆綿羊及對照組綿羊胎盤組織，分別提取總RNA，分別以反轉(zhuǎn)錄引物(5’-GCG CGT GAG CAG GCT GGA GAA ATT AAC CAC GCG CAG CCAA-3’)和(5’-GCG CGT GAG CAG GCT GGA GAA ATT AAC CAC GCG CTC CATC-3’)逆轉(zhuǎn)錄合成miR-127和miR-136 cDNA第1鏈，以此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為定量PCR模板。分別以miR-127定量 PCR引物(F:5’-ATCGGATCCGTCTGAG-3’;R:5’ -GAGCAGGCTGGAGAA-3’)及miR-136 定量 PCR引物(F:5’ -CTCCATTTGTTTTGATGATG-3;R:5’-GAGCAGGCTGGAGAA-3’)進行PCR反應，反應條件為:95℃ 1 min變性，95℃ 15 s、60℃ 30 s;40個循環(huán)。以sonRNA234為內(nèi)參進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 Rtl1-EGFP表達載體的構(gòu)建

Sekita報道，miR-127和miR-136的序列與Rtl1基因開放閱讀框內(nèi)一段序列具有互補性，miR-127和miR-136可能以RNAi方式調(diào)控Rtl1基因的表達[12]。本研究利用EGFP基因報告系統(tǒng)進一步驗證。根據(jù)GeneBank公布的綿羊Rtl1基因組序列，設計用于擴增包含miR-127靶位點的Rtl1基因片段的引物(F:5’-GCACCTTCCACTCTCCCTACTG-3’;R:5’-GCTTGGCTTTTTCTTGCACC-3’)和包含 miR-136靶位點的Rtl1基因片段的引物(F:5’-ATGATAGAACCCTCTGAAGACTCA-3’;R:5’ -AGATGACAACCCTCGCATGACT-3’)，以胎盤細胞基因組DNA為模板，PCR擴增包含miR-127和miR-136靶位點的Rtl1基因片段。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠回收試劑盒純化后，克隆至pEGFP-N1載體(Clontech)。經(jīng)XhoⅠ和SalⅠ雙酶切和測序鑒定后，獲得pRtl127-EGFP和pRtl136-EGFP表達載體。

1.2.4 EGFP熒光敲除實驗

參照Huang等[19]驗證miRNA靶基因的方法，我們利用EGFP熒光敲除實驗驗證miR-127和miR-136的靶基因。綿羊胎兒成纖維細胞的分離培養(yǎng)[14]。在轉(zhuǎn)染前一天以每孔2×105個細胞接種12孔細胞板，待細胞生長至80%～90%豐度時開始轉(zhuǎn)染。按照lipofectamine 2000說明書以100 nmol/L工作濃度的 miRNA minics和1.5 μg/孔的 Rtl1-EGFP表達載體，分別按miR-127 minics+pRtl127-EGFP組;miR-136 minics+pRtl136-EGFP組和pRtl136-EGFP組轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細胞，轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。

1.2.5 半定量RT-PCR

按照Trizol RNA提取試劑盒使用說明，提取轉(zhuǎn)染后的綿羊胎兒成纖維細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。以EGFP基因引物(F:5’ -CGACGTAAACGGCCACAAGT-3’;R:5’ -TCTGCTGGTAGTGGTCGGCG-3’)進行PCR擴增，以綿羊β-actin基因為內(nèi)參，比較Rtl1-EGFP融合基因在各個處理組細胞中的表達。Rtl1-EGFP融合基因PCR反應條件:95℃預變性5 min;94℃變性30 s，60℃復性30 s，72℃延伸50 s;35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.6 Rtl1的熒光定量RT-PCR

由于Rtl1蛋白抗體無法獲得，我們采用熒光定量PCR的方法定量分析RTL基因在正常綿羊和克隆綿羊胎盤中的表達量。根據(jù)Trizol說明書提取胎盤總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒及隨機引物合成cDNA。以此cDNA為模板，用Rtl1引物P1(5’ -GGTCGAACAGTTCTGGAATCA-3’)和 P2(5’ -GGTCGAACAGTTCTGGAATCA-3’)進 行PCR，按照SYBR熒光染料說明書進行熒光定量PCR。PCR反應條件:95℃ 15 s變性，95℃ 15 s、60℃ 15 s;72℃ 15 s 40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法計算Rtl1基因相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤中的表達

提取克隆綿羊胎盤(實驗組)及對照組綿羊胎盤組織總RNA，應用熒光定量PCR方法檢測miR-127和miR-136在胎盤組織中的表達情況。結(jié)果表明，克隆綿羊胎盤組織中miR-127和miR-136的表達量明顯高于對照組綿羊胎盤組織中的表達量，miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤組織中的表達量分別增加了3.1和2.8倍(圖1)。

圖1 miR-127和miR-136在克隆綿羊和普通綿羊胎盤中的表達分析

2.2 Rtl1為miR-127和miR-136的靶基因

從綿羊胎盤細胞基因組中，通過PCR分別擴增出含miR-136和miR-127靶位點的Rtl1基因序列，長度分別為290 bp和320 bp(圖 2)。將這兩段 Rtl1基因序列克隆至pEGFP-N1載體，經(jīng)雙酶切及測序鑒定正確，表明成功構(gòu)建 pRtl136-EGFP和pRtl127-EGFP表達載體。

圖2 miR-127和miR-136的靶位點基因序列的PCR擴增

將miR-127 minics+pRtl127-EGFP、miR-136 minics+ pRtl136-EGFP和pRtl136-EGFP分別轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細胞。24 h后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，miR-127 minics+pRtl127-EGFP組和miR-136 minics+pRtl136-EGFP組熒光強度明顯弱于對照組(pRtl136-EGFP)(圖3 A)。半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-127 minics+pRtl127-EGFP組和 miR-136 minics+pRtl136-EGFP組轉(zhuǎn)染的細胞中Rtl1-EGFP mRNA表達水平顯著減弱(圖3 B)。

圖3 miR-127和miR-136靶基因的鑒定

2.3 Rtl1在克隆綿羊胎盤中的表達分析

提取克隆綿羊胎盤及對照組綿羊胎盤組織總 RNA，應用熒光定量 PCR方法檢測Rtl1在胎盤組織中的表達情況。結(jié)果表明與對照組綿羊胎盤組織，克隆綿羊胎盤組織中Rtl1的表達量降低了3/5(圖4)。

圖4 Rtl1在綿羊胎盤中的相對表達量

3 討論

多項研究已經(jīng)表明，胎盤發(fā)育異?？赡苁窃斐煽寺游镄实拖碌闹饕蛑?，并且很多克隆動物的胎盤都表現(xiàn)出發(fā)育缺陷[8，9，20]。最近，李勁松研究組[21]利用四倍體胚胎補償技術(shù)直接證明，克隆囊胚滋養(yǎng)外胚層的發(fā)育缺陷是克隆胚胎體內(nèi)發(fā)育失敗的主要原因，進一步直接說明胎盤發(fā)育缺陷是導致克隆動物效率低下的主要原因。但目前克隆動物胎盤發(fā)育異常的分子機制尚不清楚。microRNA是一類重要的細胞生長和分化的調(diào)控分子，普通動物胎盤中表達的microRNA對胚胎的著床、胎兒的生長和發(fā)育有著重要的調(diào)控作用[22，23]。但是目前對克隆綿羊胎盤中microRNA的表達和功能研究尚未見報道。在本研究中，我們分析了miR-127和miR-136在死亡克隆綿羊胎盤組織中的表達情況，驗證了miR-127和miR-136的靶基因及分析了靶基因在胎盤中的表達情況。

本研究應用熒光定量PCR的方法分析了miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤中和普通對照綿羊胎盤中的表達量，結(jié)果表明miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤中表達量顯著高于普通對照綿羊胎盤中的表達量，說明miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤中未被正確重編程。Cui等[13]人也報道m(xù)iR-127和miR-136在克隆小鼠囊胚中未被正確重編程。本研究進一步利用EGFP熒光報告系統(tǒng)證實Rtl1是miR-127和miR-136的靶基因，并且定量分析發(fā)現(xiàn)Rtl1基因在克隆胎盤中的表達量明顯降低。表明在綿羊體細胞核移植后，miR-127和miR-136基因未被正確重編程，異常表達的miR-127和miR-136導致靶基因Rtl1基因在克隆胎盤中表達降低。已有研究表明Rtl1基因在胎盤發(fā)育過程中的發(fā)揮著重要作用，Rtl1基因過表達或缺失可導致胎盤發(fā)育異常，進而導致胎兒死亡或者新生小鼠死亡[12]。因此，miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤中的異常表達很可能導致Rtl1基因的低表達，這可能是克隆胎兒發(fā)育異常以及死亡的主要原因之一。

鑒于本研究的結(jié)果，結(jié)合Rtl1在胎盤發(fā)育過程中功能研究[12]，我們假設體細胞克隆動物死亡率較高的一個重要原因如下:供體細胞的不完全重編程導致miR-127和miR-136在克隆動物胎盤中的高水平表達，異常表達的miR-127和miR-136導致靶基因Rtl1的低表達，而胎盤中Rtl1的缺失可導致新生克隆動物死亡[12]。但該假設仍需要大量的體內(nèi)外試驗驗證。

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