孫 玥，余燕影,*，曹樹(shù)穩(wěn),2

(1. 南昌大學(xué)理學(xué)院，江西 南昌 330031； 2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

阿魏酸、根皮素和水溶性VE的抗氧化協(xié)同效應(yīng)及其配方優(yōu)化

孫 玥1，余燕影1,*，曹樹(shù)穩(wěn)1,2

(1. 南昌大學(xué)理學(xué)院，江西 南昌 330031； 2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

采用等效面分析法對(duì)抗氧化劑配方阿魏酸、根皮素和水溶性VE清除DPPH自由基能力、還原Fe3+能力及清除ABTS+·能力進(jìn)行協(xié)同性分析，結(jié)果表明：隨配方中各成分含量不同則呈現(xiàn)出協(xié)同、拮抗和相加效應(yīng)；以歸一值(OD值)作為整體效應(yīng)評(píng)價(jià)指標(biāo)并采用響應(yīng)面優(yōu)化法(RSM法)進(jìn)行配方優(yōu)化，優(yōu)化模型顯示，綜合效應(yīng)最優(yōu)配方為：阿魏酸34.9%、根皮素35.1%、水溶性VE 30%。

阿魏酸；根皮素；水溶性VE；抗氧化；等效面分析；響應(yīng)面

食用抗氧化功效因子是食品中含有的天然和合成的可食用且具有抗氧化功效的化合物總稱(chēng)，其在體內(nèi)一般通過(guò)清除自由基、絡(luò)合屏蔽催化氧化的金屬離子、使催化氧化反應(yīng)的酶失活、影響基因表達(dá)和保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸等生物分子免受損傷等途徑發(fā)揮作用[1]，阿魏酸、根皮素和水溶性VE(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)是3種天然抗氧化功效因子，目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。阿魏酸既是藥食兩用植物川芎，當(dāng)歸中的主要有效成分，又在咖啡、香蘭豆、谷殼、蔗渣、甜菜粕、麥麩和米糠及中藥阿魏、升麻、木賊中有廣泛的分布。阿魏酸是公認(rèn)的強(qiáng)抗氧化功效因子，具有抗氧化、清除自由基、保護(hù)細(xì)胞、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、改善血液和心血管系統(tǒng)功能、抗癌抗突變功效[2]；根皮素是近年來(lái)國(guó)外研究較多的一種具有明顯生物活性的新型天然食用抗氧化功效因子，具有抗氧化[3]、抗突變[4]、抗炎及免疫抑制作用[5]。VE具有抗氧化、延緩衰老、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防糖尿病并發(fā)癥和動(dòng)脈粥樣硬化、輔助治療癌癥及抗不育功能，目前國(guó)內(nèi)外廣泛將之用于配方食品(含保健食品)、藥品及化妝品領(lǐng)域[6]。許多研究發(fā)現(xiàn)，多種抗氧化功效因子聯(lián)合使用比單一組分有更好的抗氧化效果[7]，即呈現(xiàn)協(xié)同作用。其作用可能源于其相互之間構(gòu)成了氧化還原循環(huán)系統(tǒng)的不同作用部位，或其不同作用機(jī)制之間存在明顯的互補(bǔ)作用或相互修復(fù)作用[8-11]。目前有關(guān)抗氧化功效因子之間的協(xié)同增效作用研究主要局限于兩組分單指標(biāo)評(píng)價(jià)模式[12-13]，三組分以上抗氧化功效因子間協(xié)同增效作用評(píng)價(jià)模型僅見(jiàn)Liu Donghong等[14]報(bào)道。本工作擬采用等效面分析法對(duì)阿魏酸、根皮素和水溶性VE 3組分復(fù)合抗氧化劑在抗氧化體外模型中聯(lián)合作用效果進(jìn)行研究，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其配方進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步研究復(fù)合抗氧化劑的協(xié)同作用和配方優(yōu)化提供一種新方法。

圖1 阿魏酸、根皮素和Trolox的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of ferulic acid, phloretin and soluble vitamin E

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿魏酸(Fer)、根皮素(Phl)、水溶性VE(Tro)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 美國(guó)Sigma公司；鐵氰化鉀(分析純) 廣州化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鈉、三氯化鐵、磷酸氫二鈉(分析純)、三氯乙酸(分析純) 廣東西隴化工廠；90%乙醇；超純水。

UV-2450 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；PHS-3C 精密酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司；HH-1恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

將阿魏酸、根皮素、水溶性VE減壓干燥(40℃)2h，取所需用量，用乙醇溶解成終濃度為1μmol/L的儲(chǔ)備液，由儲(chǔ)備液配制成所需的比例，冷藏。

ABTS儲(chǔ)備液的配制：將常溫、避光靜置過(guò)夜(16h)的5mL 7mmol/L的ABTS陽(yáng)離子/ K2S2O8儲(chǔ)備液用80%乙醇溶液稀釋成工作液，要求在常溫下 734nm波長(zhǎng)處吸光度為0.7±0.02。

1.2.2 抗氧化模型

1.2.2.1 DPPH 模型

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，依靠整個(gè)分子上備用電子的離域作用而保持穩(wěn)定，以致不能形成二聚體。當(dāng)DPPH溶液與能提供氫原子的抗氧化劑混合時(shí)，被還原，顏色發(fā)生變化，由深紫色變?yōu)榈S色，常用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其吸光度[15]。改進(jìn)Maisuthisakul等[16]方法，DPPH配制成6×10-5mol/L，0.5mL DPPH與不同濃度的受試物混合，用無(wú)水乙醇定容到5mL，充分搖勻。室溫暗光下反應(yīng)30min，在波長(zhǎng)517nm處測(cè)定其吸光度，平行3次。DPPH自由基清除能力由式(1)計(jì)算。

式中：Ac為未加受試物的吸光度；As為加受試物的吸光度。

1.2.2.2 Fe3+還原模型

參照Lee 等[17]方法，取2.5mL不同濃度的受試物與2.5mL的PBS(pH6.6)緩沖溶液混合后，加2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%的鐵氰化鉀溶液于50℃水浴20min，然后加入2.5mL三氯乙酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)，混勻。降到室溫后，取2.5mL上清液，加入0.5mL三氯化鐵(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%)溶液，用蒸餾水定容至5mL，完全顯色后以試劑空白做參比，于波長(zhǎng)700nm處測(cè)吸光度，吸光度越強(qiáng)，還原能力越強(qiáng)。

1.2.2.3 ABTS模型

ABTS經(jīng)氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)色陽(yáng)離子自由基ABTS+·，抗氧化物質(zhì)與ABTS+·發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。參照Ozgen等[18]的方法，經(jīng)改進(jìn)，4.5mL的ABTS+·工作液與不同濃度受試物混合，無(wú)水乙醇定容至5mL，常溫避光靜置6min，在734nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，平行3次。

式中：A1為不加樣品，加入ABTS的吸光度；A2為加入樣品和ABTS的吸光度。

1.2.3 協(xié)同作用分析模型

采用IC50值(半數(shù)抑制率值)為評(píng)估抗氧化能力大小的指標(biāo)。協(xié)同效果的評(píng)價(jià)采用等效面分析法分析。

等效面分析法：本研究按 Luszczki等[19]報(bào)道的等輻射法并略加改進(jìn)，研究3組分抗氧化劑協(xié)同作用，具體步驟如下：

1)選擇合適的指標(biāo)。首先采用Probit 回歸分析[20]做各樣品的劑量-效應(yīng)曲線，并計(jì)算IC50，平行3次。

2)采用“centroid simplex”[21]設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)7個(gè)比例配方，根據(jù)Loewe[22]的方法，由相加等效公式分別計(jì)算它們的理論值IC50add±s。

3)依權(quán)重計(jì)算實(shí)驗(yàn)值IC50mix中各組分實(shí)際產(chǎn)生的抗氧化能力數(shù)值。

4)采用非配對(duì)t檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)理論值與實(shí)驗(yàn)值之間的顯著性。

5)判斷。將3種藥物的實(shí)驗(yàn)值IC50mix及95%置信區(qū)間分別繪制在三維坐標(biāo)軸上，兩兩相連成等效相加面及上置信面和下置信面，將7個(gè)比例測(cè)得的IC50mix標(biāo)繪在坐標(biāo)軸上，點(diǎn)的位置由以下公式判定：設(shè)Ferc/Fers，Phlc/Phls，Troc/Tros為配方中阿魏酸，根皮素和水溶性VE占各自IC50的分?jǐn)?shù)，當(dāng)Ferc/Fers+ Phlc/Phls+Troc/Tros=1時(shí)，則點(diǎn)在平面上；當(dāng)Ferc/Fers+ Phlc/Phls+Troc/Tros＜1時(shí)點(diǎn)在平面下；當(dāng)Ferc/ Fers+ Phlc/Phls+Troc/Tros＞1時(shí)點(diǎn)在平面上，如果點(diǎn)落在下置信面下方則為協(xié)同，在上置信面上方為拮抗，落在中間置信區(qū)間區(qū)域內(nèi)為相加作用。

1.2.4 配方優(yōu)化模型

響應(yīng)面(RSM)是將數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)合起來(lái)，在響應(yīng)指標(biāo)與因素之間建立起某種經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷囊环N技術(shù)，主要通過(guò)多元回歸分析法分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所獲得的定量數(shù)據(jù)同時(shí)解決多元方程，常用來(lái)研究交互關(guān)系及優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件[23]。比例優(yōu)化采用“centroid simplex”設(shè)計(jì)，選擇線性、二項(xiàng)式或立方模型去擬合數(shù)據(jù)，失擬程度(lack-of-fit)顯著性差異采用P＜0.05[24-25]，模型質(zhì)量采用單因素方差分析，優(yōu)化方法依據(jù)Derringer等[26]的方法，優(yōu)化方程如下：

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 協(xié)同分析

A.清除DPPH自由基能力；B.清除ABTS+·能力；C.還原Fe3+能力。

由圖2可知，受試樣品在3種抗氧化模型中均有良好的抗氧化效果，抗氧化能力隨著樣品濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，且在同種模型中，任意同等濃度3種樣品抗氧化活性大小順序一致。3種物質(zhì)在3種抗氧化模型中抗氧化能力大小順序不同。在DPPH模型中，3種抗氧化劑的抗氧化能力大小是水溶性VE＞阿魏酸＞根皮素，其IC50mix(95%置信區(qū)間)分別為阿魏酸22.746(20.335～25.156)μmol/L、根皮素46.980(42.983～50.976)μmol/L、水溶性VE 10.348(9.312～11.384)μmol/L。DPPH模型機(jī)理是自由基接受抗氧化劑的活潑氫或電子而褪色，其抗氧化活性大小與酚羥基官能團(tuán)的數(shù)目有關(guān)[27-28]，可能與3種樣品的分子結(jié)構(gòu)及失去活性后半醌式自由基穩(wěn)定性及溶劑的極性和物質(zhì)在溶劑中的溶解度有關(guān)[29]。在Fe3+還原模型中，同等濃度下，3種抗氧化劑的活性大小為阿魏酸＞水溶性VE＞根皮素，其抗氧化強(qiáng)度IC50mix(95%置信區(qū)間)分別為阿魏酸30.080(28.952～31.207)μmol/L、根皮素51.278(49.318～53.239)μmol/L、水溶性VE 32.672(31.160～34.185)μmol/L。在此模型中Fe3+獲得由抗氧化劑提供的電子，進(jìn)而被還原成Fe2+，用于測(cè)定抗氧化物質(zhì)基于電子轉(zhuǎn)移的總的抗氧化能力的大小。樣品清除ABTS+·的能力與清除DPPH自由基的能力順序相反，根皮素最強(qiáng)，阿魏酸次之，水溶性VE最弱，其IC50mix(95%置信區(qū)間)分別為1.502(1.460～1.544)μmol/L、3.360(3.006～3.715)μmol/L、9.712(9.244～10.180)μmol/L。3種抗氧化劑在3種體外化學(xué)模型中協(xié)同作用分析分別見(jiàn)表1～3。

表1 3種抗氧化劑在DPPH模型中協(xié)同作用效果分析Table 1 Synergistic DPPH free radical scavenging activity of three antioxidants

表2 3種抗氧化劑在Fe3+還原模型中協(xié)同作用效果分析Table 2 Synergistic Fe3+ reducing power of three antioxidants

表3 3種抗氧化劑在ABTS+·模型中協(xié)同作用效果分析Table 3 Synergistic ABTS free radical scavenging activity of three antioxidants

由表1～3可知，在清除DPPH模型中7種配方的IC50mix值中單種物質(zhì)所占的比重均低于理論上所占的比重，且實(shí)際產(chǎn)生的效應(yīng)均低于理論上所產(chǎn)生的效應(yīng)。Fer∶Phl∶Tro 為 1∶1∶4 時(shí)有最強(qiáng)的抗氧化效果，IC50mix為(13.837 ± 0.754)μmol/L；在還原 Fe3+模型中 Fer∶Phl∶Tro 4∶1∶1 的 IC50mix值(33.371± 0.258)μmol/L 低于理論值(34.045±0.206)μmol/L，且低于其他配方的IC50mix值；由此可見(jiàn)當(dāng)配方中抗氧化活性較強(qiáng)的組分含量較大時(shí)其抗氧化效果越強(qiáng)，說(shuō)明在DPPH模型和還原Fe3+模型中活性較強(qiáng)的抗氧化劑在配方中占主導(dǎo)作用。在ABTS模型中，根皮素是抗氧化活性較強(qiáng)的組分，但半數(shù)抑制率值IC50mix最小的配方不是根皮素含量高的配方Fer∶Phl∶Tro為1∶1∶4，而是Fer∶Phl∶Tro 為 1∶1∶1 配方，這說(shuō)明協(xié)同作用占主導(dǎo)地位。

3種模型中非配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)測(cè)得配方的IC50mix值與由相加等效公式得到的理論值IC50add有顯著差異。one-way ANOVA(P＜0.05)分析結(jié)果顯示不同比例的IC50mix之間有顯著性差異。協(xié)同分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3種模型中不同比例的藥物協(xié)同效應(yīng)分析結(jié)果Table 4 Synergistic antioxidant effects of mixtures of three antioxidants at different ratios

由表4可知，隨組分含量的不同呈現(xiàn)的協(xié)同性不同，組合配方的IC50值低并不一定其協(xié)同作用就高，例如在還原Fe3+模型中4∶1∶1配方的IC50mix值比1∶4∶1配方的IC50mix值要小，然而后者具有協(xié)同作用而前者呈現(xiàn)相加作用。

2.2 配方優(yōu)化

抗氧化功效因子的食用安全性在食品配方中是必須要考慮的因素，一是發(fā)展新型的天然可食用抗氧化功效因子，二是對(duì)已有的食用抗氧化功效因子進(jìn)行配方優(yōu)化。介于開(kāi)發(fā)新型抗氧化功效因子的成本問(wèn)題，更多趨向于配方優(yōu)化。出于安全性考慮，人類(lèi)在配方食品(特別是保健食品)的配方設(shè)計(jì)中總是希望在有限添加抗氧化功效因子前提下，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)健康效應(yīng)最大化。借助抗氧化功效因子間的協(xié)同增效作用來(lái)合理設(shè)計(jì)配方有可能是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的較好方法之一。而等效面分析結(jié)果表明在不同的模型中7種比例的IC50mix點(diǎn)相對(duì)于等效相加面位置不同，呈現(xiàn)出一定的協(xié)同、相加和拮抗作用，說(shuō)明利用其協(xié)同程度的不同進(jìn)行配方優(yōu)化是可行的。

本實(shí)驗(yàn)擬選用協(xié)同系數(shù)R為指標(biāo)[30]，總評(píng)“歸一值”(OD)表達(dá)整體效應(yīng)[31]，建立響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型進(jìn)行配方優(yōu)化。配方協(xié)同系數(shù)和總評(píng)歸一值見(jiàn)表5，響應(yīng)面分析見(jiàn)圖3，3個(gè)模型及總評(píng)歸一中配方優(yōu)化擬合方程見(jiàn)表6。

表5 配方的協(xié)同系數(shù)R及OD值Table 5 Synergistic coefficients and OD values of mixtures of three antioxidants at different ratios

在DPPH模型中采用二次項(xiàng)交互(quadradic)模型，模型中采用增加交互項(xiàng)來(lái)減小失擬程度，提高了方程的擬合效果。結(jié)果顯示P＜0.0001，失擬程度為0.0096，校正擬合度(R2Adj=0.9357)與預(yù)測(cè)擬合度(R2pre= 0.8910)很接近，說(shuō)明響應(yīng)面方程無(wú)需做進(jìn)一步優(yōu)化，信噪比為13.505，模型可用于預(yù)測(cè)。優(yōu)化結(jié)果顯示當(dāng)x1=0.174，x2=0.306，x3=0.520，R有最高值1.36，優(yōu)化方程中βPhl＜βFer＜βTro，說(shuō)明各因素對(duì)符合抗氧化劑活性影響程度為根皮素＜阿魏酸＜水溶性VE，配方中水溶性VE對(duì)復(fù)合配方中的協(xié)同效應(yīng)占主導(dǎo)地位，兩兩組分相互作用系數(shù)為正，說(shuō)明兩種組分的混合對(duì)協(xié)同效果有正效應(yīng)，反之則有負(fù)效應(yīng)，這與前面的協(xié)同分析結(jié)果相一致。

圖3 以阿魏酸，根皮素和Trolox 為變量使用擬合方程預(yù)測(cè)OD值的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots showing the effects of ferulic acid, phloretin and soluble vitamin E on OD value

采用Special Cubic 模型來(lái)分析ABTS模型和Fe3+還原模型，ABTS模型配方優(yōu)化結(jié)果x1=0.326，x2=0.311，x3=0.363時(shí)有最大協(xié)同度(R=1.96)，優(yōu)化方程中根皮素與阿魏酸的擬合系數(shù)為－1.07043，說(shuō)明對(duì)協(xié)同度有負(fù)貢獻(xiàn)，這與協(xié)同判定1∶1∶0成拮抗效應(yīng)相符。Fe3+還原模型配方優(yōu)化結(jié)果x1=0.366，x2=0.377，x3=0.257時(shí)有最大協(xié)同程度(R=1.10)，優(yōu)化方程中根皮素與水溶性VE的擬合系數(shù)為－0.31718，阿魏酸與水溶性VE的擬合系數(shù)為－0.32252，說(shuō)明對(duì)協(xié)同度有負(fù)貢獻(xiàn)，這與協(xié)同判定1∶0∶1 和 0∶1∶1 成拮抗效應(yīng)相符。

表6 在不同模型中的擬合方程Table 6 Polynomial regression equations for DPPH radical scavenging activity, Fe3+ reducing power, ABTS radical scavenging activity and OD value

采用Special Cubic 模型擬合方程來(lái)優(yōu)化OD值，經(jīng)過(guò)優(yōu)化綜合效應(yīng)模型發(fā)現(xiàn)當(dāng)配方組成為阿魏酸34.9%、根皮素35.1%、水溶性VE 30%時(shí)OD值最大。據(jù)此，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得其協(xié)同系數(shù)在3個(gè)模型中分別為1.31、2.12和1.10，OD值為0.84。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用等效面分析法考察阿魏酸、根皮素及水溶性VE 3種抗氧化劑協(xié)同作用效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3種物質(zhì)聯(lián)合使用其抗氧化活性具有一定的協(xié)同作用，且協(xié)同度受配方比例的影響，即取相同用量不同比例的配方抗氧化劑所產(chǎn)生的抗氧化效果不同。

通過(guò)選用協(xié)同度R為指標(biāo)，以總評(píng)“歸一值”(OD)表達(dá)整體效應(yīng)建立的響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型進(jìn)行配方優(yōu)化，獲得最佳綜合效應(yīng)配方為：阿魏酸34.9%、根皮素35.1%、水溶性VE 30%。配方組分之間的協(xié)同作用可能與3種物質(zhì)的不同作用機(jī)制之間存在明顯的互補(bǔ)作用有關(guān)。由于抗氧化劑在不同抗氧化模型中作用機(jī)理不同，因而同一配方在不同抗氧化模型中協(xié)同效果也就不同，因此，建立一種科學(xué)客觀評(píng)價(jià)多組分食品添加劑之間協(xié)同作用效果和配方優(yōu)化模型對(duì)研究食品、化妝品等體系的配方優(yōu)化具有一定的理論指導(dǎo)意義。

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Synergistic Effect and Formulation Optimization of Three Antioxidant Food Factors

SUN Yue1，YU Yan-ying1,* ，CAO Shu-wen1,2
(1. School of Science, Nanchang University, Nanchang 330031, China；2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In this work, equivalent surface analysis was used to evaluate the synergistic effect of a new antioxidant formula containing ferulic acid, phloretin and soluble vitamin E on DPPH radical scavenging activity, Fe3+reducing power and ABTS radical scavenging activity. The results indicated different mixing ratios of the antioxidant factors exhibited a synergistic,antagonistic, or additive effect to some extent. In this study, response surface methodology (RSM) was adopted for optimizing the formulation of the antioxidant factors to achieve the highest OD (overall desirability) value. The optimal formulation consisted of 34.9% ferulic acid, 35.1% phloretin and 30% soluble vitamin E.

ferulic acid；phloretin；soluble vitamin E；antioxidant；equivalent surface analysis；RSM

TS202.3

A

1002-6630(2012)03-0033-06

2011-03-08

食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索項(xiàng)目(SKLF-TS-200914)

孫玥(1987—)，女，碩士，主要從事天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與研究。E-mail：sunyue@ncu.edu.cn

*通信作者：余燕影(1963—)，女，教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與研究。E-mail：yuyanying@ncu.edu.cn